НЕФТЕХИМИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 476-480
УДК 638.543.96
БИОДЕГРАДАЦИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И ФЕНОЛОВ БАКТЕРИЯМИ, ВЫДЕЛЕННЫМИ ИЗ ВОД И ГРУНТОВ КАСПИЯ
© 2013 г. М. Г. Велиев, М. А. Салманов1, А. А. Бабашлы1, С. Р. Алиева1, Н. Р. Бекташи
Институт полимерных материалов НАН Азербайджана, Сумгаит Институт микробиологии НАН Азербайджана, Баку E-mail: mveliyev@mail.ru Поступила в редакцию 25.02.2013 г.
Проведены экспериментальные исследования по изучению способности деградации моноароматических углеводородов (бензол, толуол, этилбензол) и фенолов (фенол, пирокатехин, гидрохинон, тетрахлорпирокатехин) бактериями, выделенными из прибрежных вод и грунтов Апшеронского полуострова Каспийского моря. Показано, что процесс деградации пирокатехина, в частности бактериями Pseudomonas sp., протекает с расщеплением ароматического кольца в двух направлениях (по мета- и орто-положениям), а деградация тетрахлорпирокатехина протекает с расщеплением ароматического кольца в орто-положении и образованием тетрахлормуконовой кислоты. Методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) было выявлено и идентифицировано свыше десяти индивидуальных соединений в составе продуктов биодеградации в исследуемых условиях. Показано также, что в случае пирокатехина и гидрохинона фиксируются в основном линейные функциональные соединения, образующиеся за счет раскрытия ароматического кольца в мета- и орто-положениях.
Ключевые слова: биодеградация, фенолы, ароматические углеводороды, микроорганизмы, микробиологический синтез, жидкостная хроматография.
Б01: 10.7868/80028242113050109
Известно, что ароматические соединения широко распространены в природе [1—4] и являются приоритетными загрязнителями окружающей среды [5—7]. Из всех подходов к решению проблемы очистки среды от ароматических соединений наиболее перспективна их микробиологическая деградация. Микроорганизмы-деструкторы ката-болизируют ароматические вещества, превращая их в гидроксилированные производные с последующим раскрытием бензольного кольца и образованием многочисленных легкоутилизируемых субстратов [1, 8—12]. Получающиеся продукты биодеградации представляют интерес с точки зрения исследования основных принципов утилизации (биодеградации) ароматических соединений и перспективы их использования в биотехнологиях очистки окружающей среды. Изучение микробиологической деградации нефтяных углеводородов, в т.ч. фенольных соединений, имеет важное значение для разработки методов биологической очистки окружающей среды от нефтяных и фенольных загрязнений [13—15], поэтому нами были продолжены исследования в этом направлении [13, 16, 17].
Цель настоящей работы — исследование продуктов биодеструкции некоторых моноароматических углеводородов (бензол, толуол, этилбензол) и фенолов (фенол, пирокатехин, тетрахлорпирока-техин, гидрохинон) бактериями, выделенными из воды и грунта Апшеронского полуострова Каспийского моря.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Для выделения бактерий использовалась среда Столбунова [18]. Соленость среды доводили до 13%. Для выделения бактерий на агаризованные среды МПА (мясопептонный агар), использовали общеизвестные микробиологические методы [19]. Выделенные бактерии на основании их морфологических и физиолого-биохимических признаков были отнесены к родам Micrococcus, Bacillus, Pseudomonas, Arthrobacter, Mycobacterium, Acinetobacter, Aeromonas, Vibrio, Sarcina, Alcaligenes по определителю Берджи [20].
Интенсивность процесса биодеградации косвенно оценивали по накоплению биомассы бактерий, развивающихся на индивидуальных ароматических и фенольных соединениях в течение
месяца. В этом эксперименте в качестве посевного материала использовали 1—2 суточные культуры микроорганизмов, выращенные на МПА. Клетки смывали 10 мл дистиллированной воды, затем 5 мл полученной суспензии вносили в колбы с 0.1 л питательной среды, содержащей в качестве единственных источников углерода бензол, толуол, фенол, пирокатехин, тетрахлорпирокатехин. Во всех экспериментах культуры инкубировали при температуре 28°С. Далее изучали динамику численности бактерий и процессы биодеградации ароматических соединений, добавленных в среду в коцентра-циях 100, 300, 500 мг/л. После термостатирования из культуральной среды, освобожденной от клеток фильтрованием, экстрагировали продукты биодеструкции равным объемом хлороформа.
Продукты процесса деструкции ароматических и фенольных соединений исследовали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Анализы проб исходных и остаточных, после биодеструкции, ароматических соединений проводили также ЯМР- и ИК-спектроскопическими методами [21-23].
Хроматографические исследования проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "Kovo" (Чехия), с УФ-спектрофо-тометрическим детектором, с рабочей длиной волны X = 254 нм. Использовались две колонки размером 3.3 х 150 мм, заполненные обращенной неподвижной фазой "Separon SGX-C18", размером частиц 7 мкм, температурой среды 20-25°С. Элюент метанол : вода (75 : 25 об. %). Скорость подвижной фазы 0.3 мл/мин. Идентификацию компонентов выполняли сопоставлением параметров удерживания стандартной смеси и продуктов биотрансформации. Стандартные растворы с концентраций 1-1.5 мг/мл готовили в элю-риующей системе метанол : вода (75 : 25 об. %) по общепринятой методике [23, 24]. Структурный состав биодеградации индивидуальных углеводородов и фенольных соединений определяли методами: ИК-спектроскопии (UR-20) (тонкий слой) в диапазоне спектра 4000-700 см-1; для спектров ЯМР1Н - прибор "Tesla BS-487B" с рабочей частотой 80 мГц в СС14 c использованием гексаме-тилдисилоксана (ГМДС) в качестве внутреннего стандарта. Для всех экспериментов проведены контрольные опыты (без внесения бактерий-биодеструкторов).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенные эксперименты показали, что все исследуемые ароматические углеводороды и фе-нольные соединения служили единственным источником углерода для роста каждой из выделенной группы бактерий. Из выделенных штаммов бактерий 47% росли на бензоле, 54%-на этилбен-
Выход сухой биомассы, г/л
5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
0
fg
1 c
f g b.
fg a C,ie I
¿ail
t
1 2 3 4 Недели
ua IIb ■ j с l d i ; e iifBg
Выход биомассы Pseudomonas sp. при росте на ароматических (a — толуол, b —бензол, с — этилбензол) и фенольных (d — гидрохинон, e — тетрахлорпирокате-хин, f —пирокатехин, g — фенол) соединениях.
золе, 43% на толуоле, 100% на феноле и пирокатехине, 70% на гидрохиноне, 13% на тетрахлорпи-рокатехине. Накопление биомассы на среде с добавлением ароматических (бензол, толуол, этилбензол) и фенольных (фенол, пирокатехин, гидрохинон, тетрахлорпирокатехин) соединений при концентрации 500 мг/л представлено на рисунке. Как следует из рисунка, накопление биомассы штамма Pseudomonas sp. более интенсивно проходило при утилизации фенольных соединений, чем ароматических; биомасса при этом изменялась от 1.6 г/л до 4.5 г/л.
Полученные результаты показывают, что деградация исследуемых соединений под воздействием вышеуказанных микроорганизмов сопровождается трансформацией их в соответствующие фенолы, карбоновые и фенолкарбоновые кислоты, многоатомные фенолы, бензохиноны, а также в малых количествах — в полимеры. Следует отметить, что идентификация продуктов биотрансформации методом ВЭЖХ осуществлена на завершающейся стадии микробиологического синтеза с образованием индивидуальных органических соединений.
Как следует из хроматографических анализов, деградация бензола, начинающаяся окислением ароматического кольца, через 6 сут сопровождается образованием пирокатехина и фенола 30% и 60% соответственно.
Наряду с хроматографическими анализами были изучены данные ИК- и ЯМР1Н спектроскопии, подтверждающие строение продуктов. В ИК-спектрах продуктов биодеградации бензола наряду с полосами поглощения характерными для фе-нильного кольца, обнаружены также полосы в области 3590—3650 см-1 характерные для гидрок-сильной группы. В их ЯМР1Н-спектрах химические сдвиги протонов ароматического кольца и
g
c
b
e
e
a
d
a
478
ВЕЛИЕВ и др.
гидроксильной группы обнаружены при 8 = 6.25— 7.2 м.д. и 8 = 7.65—9.00 м.д. соответственно [21, 22].
В случае деградации толуола зафиксированы в основном 3 индивидуальных соединения, доминирующим количеством среди которых обладали о-крезол (50 %), бензойная кислота (30%), а также
2,3-дигидрокситолуол (10%). Трансформация происходила с образованием промежуточных веществ и, следовательно, на основании известных теоретических представлений, схему биодеградации, толуола, под воздействием Pseudomonas sp. можно представить следующим образом:
В ИК-спектрах продуктов биодеградации толуола наряду с полосами поглощения, характерными для Ar—CH3, обнаружены также полосы, характерные для гидроксильной (3590—3650 см-1) и карбоксильной (1680-1700 см-1) групп. В ЯМР1Н-спек-тре продуктов деградации найдены сигналы в области 8 = 2.1-2.8 м.д., 8 = 7.70-9.00 м.д. и 8 = = 9.5-10.5 м.д. свойственные для протонов групп Ar-CH3, Ar-OH и Ar-COOH.
В работе [13] показано, что этилбензол под воздействием микромицетов в соокислительных условиях превращается в ацетофенон и фенилук-сусную кислоту. В отличие этого, исследования в данной работе показали, что деградация этил-бензола под воздействием бактерий рода Pseudomonas sp. протекает с образованием, кроме ацетофенона (28%) и фенилуксусной кислоты (45%), еще и бензоилмуравьиной кислоты (30%) по схеме:
CH снз COOH COOH
Таким образом, в разработанных условиях трансформации толуола и этилбензола происходят одновременно по двум направлениям, с окислением боковой цепи и ароматического кольца. Несмотря на то, что деградация толуола по смешанному механизму известна из литературы [8], состав продуктов окисления в данном случае отличается от ранее обнаруженного. Так, в работах [12, 13] показано, что в зависимости от вида микроорганизмов деградация толуола происходит в различных направлениях. Любопытно отметить, что соединения, образовавшиеся в ранее проведенных экспериментах [13, 16, 17], в в данной работе не были зафиксированы. Это говорит о том, что
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.