научная статья по теме БИОДЕГРАДАЦИЯ ФЕНАНТРЕНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 И BURKHOLDERIA SP. BS3702 В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «БИОДЕГРАДАЦИЯ ФЕНАНТРЕНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 И BURKHOLDERIA SP. BS3702 В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 4, с. 484-490

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =

УДК 579.222.2+579.252.5

БИОДЕГРАДАЦИЯ ФЕНАНТРЕНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 И BURKHOLDERIA SP. BS3702

В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ

© 2009 г. А. А. Овчинникова*'1, А. А. Ветрова*' **, А. Е. Филонов*' **, А. М. Воронин*' **

*Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 15.07.2008 г.

Было изучено взаимодействие штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов Pseudomonas putida BS3701 и Burkholderia sp. BS3702 в процессе деградации фенантрена в ризосфере растений. Было обнаружено накопление токсичной для растений 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты штаммом BS3702, которая затем потреблялась штаммом BS3701, тем самым повышая устойчивость растений к загрязнителю и токсичному интермедиату. При таком типе взаимодействия (кооперация) было отмечено снижение эффективности деградации фенантрена.

Ключевые слова: полициклические ароматические углеводороды, фиторемедиация, ризосфера.

В результате роста промышленного производства биосфера стала не в состоянии справляться с потоком антропогенного загрязнения. Одним из современных подходов, применяемых для борьбы с загрязнениями окружающей среды является фиторемедиация, т.е. использование растений и ассоциированных с ними микроорганизмов для очистки почвенных и водных экосистем от различных поллю-тантов. В основе этой технологии лежит так называемый ризосферный эффект, который усиливает микробную деградацию загрязнителя в почве. Этому процессу способствуют корневые экссудаты растений, которые обеспечивают популяции ризо-сферных микроорганизмов-деструкторов дополнительными источниками углерода, энергии, иногда кислорода, а также микроэлементами и ферментами [1], а прорастание почвы корнями помогает растениям, микроорганизмам и загрязнителю вступать во взаимодействия друг с другом. Основные достоинства фиторемедиации состоят в возможности рекультивации больших территорий, относительно низкой стоимости по сравнению с другими технологиями, высокой эффективности и отсутствии негативного воздействия на окружающую среду [2].

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - распространенные и устойчивые загрязнители окружающей среды, являющиеся результатом сжигания ископаемого топлива и побочными продуктами индустриальной активности. Основной вклад в их деградацию вносят гетеротрофные мик-

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: Anastasia_777@ram-bler.ru).

роорганизмы, которые способны использовать углеводороды нефти в качестве основного источника энергии и углерода. К настоящему времени растет понимание того, что скорость деградации ПАУ в окружающей среде может зависеть от метаболизма отдельных видов микроорганизмов и возможностей целых микробных сообществ [3]. Исходя из этого, в процессе биоремедиации все чаще используют не монокультуры, а ассоциации бактерий. При этом очень важную роль играют процессы кометаболиз-ма и кооперации. Для использования более сложных микробных комплексов в биотехнологических целях необходимо учитывать внутренние сукцессионные перестройки и межпопуляционную динамику, в результате которой свойства сообщества во времени претерпевают существенные изменения [3].

Исследования в направлении фиторемедиации проводятся во многих странах мира, однако взаимодействие составляющих биотехнологии (микроорганизмы, растения, загрязнители) мало изучено.

Целью работы являлось изучение взаимодействия микроорганизмов-деструкторов и его влияния на эффективность биодеградации фенантрена в ризосфере растений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. В работе использовали штаммы бактерий Pseudomonas putida BS3701 (pBS1141, pBS1142) и Burkholderia sp. BS3702 (pBS1143) (таблица), выделенные из почвенных образцов, загрязненных нефтепродуктами и отходами

БИОДЕГРАДАЦИЯ ФЕНАНТРЕНА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ PSEUDOMONAS PUTIDA 485 Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе

Штамм Характеристика Источник

Pseudomonas putida BS3701 (pBS 1141, pBS 1142) Burkholderia sp. BS3702 (pBS 1143) Nah+ Sal+ 2MeNah+ Gnt+ Phn+ Hna+ Nah+ Sal+ Phn+ Ant+ Hna- ЛБП, ИБФМ РАН ЛБП, ИБФМ РАН

Примечание. Nah+ - способность к росту на нафталине; 2MeNah+ - на 2-метилнафталине; Gnt+ - на гентизате; Phn+ - на фенантрене; Ant+ - на антрацене; Hna+ на - 1-гидрокси-2-нафтойной кислоте; Sal+ - на салицилате. ЛБП - лаборатория биологии плазмид; ИБФМ РАН - Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук.

коксохимического производства с территории Московской области, и описанные как деструкторы нафталина и фенантрена [4, 5].

Питательные среды. Бактерии выращивали на полноценных питательных средах LB-агаре и LB-бульоне [6], содержащих (в г/л): бакто-триптона ("Difco") - 10.0, дрожжевого экстракта ("Difco") -5.0, NaCl - 10.0.

B качестве минимальной среды для бактерий использовали синтетическую среду Эванса [7] следующего состава (г/л): К2НР04 - 8.71; 5 М р-р NH4Cl - 1; 0.1 M p-p Na2SO4 - 1; 62 мМ p-p MgCl2 - 1; 1 мМ p-p CaCl2 - 1; 0.005 мМ p-p (NH4)6Mo7O24 ■ 4H2O - 1; микроэлементы - 1. Состав раствора микроэлементов в 10% HCl, (г/л): ZnO - 0.41; FeCl2 ■ 6H2O - 5.4; MnCl2 ■ 4H2O - 2.00; CuCl2 ■ 2H2O - 0.17; CoCl2 ■ ■ 6H2O - 0.48; H3BO3 - 0.06; pH 7.0.

Для получения агаризованных сред добавляли 20 г/л агара ("Pronadisa", Испания).

Выращивание микроорганизмов на агаризован-ной минеральной среде с использованием нафталина или фенантрена в качестве единственного источника углерода и энергии проводили в парах этих веществ. Среду Кинга Б (KB) [8] использовали для мониторинга штаммов. При культивировании микроорганизмов в жидкой среде нафталин и фенан-трен добавляли в виде пудры в концентрации 2 и 0.5 г/л соответственно.

Гнотобиотическая система для выращивания растений [9]. Выращивание растений проводили в закрытых пластиковых сосудах размером 77 х 77 х х 97 мм (Magenta vessel, "Sigma") в 150 г песка. Фе-нантрен вносили в виде пудры в концентрации 500 мкг/г песка.

Для обеспечения минерального питания растений использовали среду "Murashige and skoog basal salt" ("Sigma"). Положительным контролем служили растения, выращенные без добавления фенантрена и без инокуляции, отрицательным - с добавлением фенантрена и без инокуляции.

Стерилизация семян. Семена горчицы белой (Sinapis alba L.) стерилизовали 5% раствором гипо-хлорита натрия в течение 3 ч, затем промывали 4 раза стерильной водопроводной водой в течение 2 ч. Семена раскладывали на чашки с LB-агаром и инкубировали 18-20 ч при 24°С для контроля стерильности семян.

Интродукция микроорганизмов-деструкторов в модельные системы. В эксперименте суспензию микроорганизмов вносили непосредственно в песок вместе с минеральной средой, концентрация микроорганизмов составляла 1.5 х 108 КОЕ/г песка.

В один горшок высевали 20 проростков горчицы. Растения выращивали в следующем режиме: 12-часовой световой период и 12-часовой темновой период при температуре 20°С. Через 7 дней делали смывы с корней и с ризосферы на ЬВ-агар и среду КВ для качественного и количественного анализа бактерий.

Схема эксперимента. Для изучения взаимодействия штаммов-деструкторов и оценки убыли фенантрена использовали следующие модельные системы:

1. с фенантреном, без микроорганизмов и растений - для оценки абиотической убыли фенантрена;

2. с растениями, без микроорганизмов и фенантрена в качестве контроля биометрических характеристик горчицы белой;

3. с растениями, без микроорганизмов, с фенантреном - для оценки фитотоксического эффекта фенантрена на растения;

4. с растениями, фенантреном и штаммом В83701 - для исследования влияния интродукции штамма-деструктора ПАУ на биометрические характеристики горчицы белой в присутствии загрязнителя, изучения численности бактерий в ризосфере и ризоплане растений, а также для изучения влияния штамма В83701 на эффективность деградации фенантрена;

5. с растениями, фенантреном и штаммом В83702 - для исследования влияния интродукции штамма-деструктора ПАУ на биометрические характеристики горчицы белой в присутствии загрязнителя, изучения численности бактерий в ризосфере и ризоплане растений, а также для изучения влияния штамма В83702 на эффективность деградации фенантрена;

6. с растениями, фенантреном, штаммами В83701 и В83702 - для исследования влияния совместной интродукции штаммов-деструкторов ПАУ на биометрические характеристики горчицы белой в присутствии загрязнителя и на эффективность деградации фенантрена, а также для изучения численности микроорганизмов в ризосфере и ризоплане растений.

5

3 4.

44. £3 «3

Ют

О 2.

К 2.

я

е!1

г4п

I

гЬ

I

Г*1

Ь

Растения Растения Растения Растения

^ Фенантрен Фенантрен Фенантрен

Растения г г г

Фенантрен Б83701 Б83702 Б83701 + Б83702

Рис. 1. Длина побега горчицы белой через 7 сут культивирования. Стрелками отмечены варианты с лучшим защитным эффектом.

Определение содержания фенантрена в образцах. 150 г песка из модельной системы переносили в колбу и экстрагировали 100 мл метанола в течение 16 ч при 25°С. Затем 200 мкл метанольного экстракта анализировали с помощью ВЭЖХ, используя хроматограф LKB-2150 (Швеция): колонка C18 ("Nova Pak Waters", США), система 60% метанол -40% вода, УФ детектор, рабочая длина волны 280 нм, скорость потока 1 мл/мин. Расчет концентрации фенантрена производили по площади пика по сравнению с площадью пика контрольного образца.

Кинетика роста микроорганизмов на фенантре-

не. Определение удельной максимальной скорости роста в периодической культуре на фенантрене проводили при выращивании микроорганизмов в колбах со средой Эванса (250 мл). Фенантрен вносили в виде пудры (500 мг/л). В качестве инокулята использовали культуры, выращенные на среде Эванса с фенантреном. Начальная концентрация бактерий в колбах составляла 1-4 х 105 кл/мл. Оптическую плотность культуральной жидкости определяли спектрофотометрически на ФЭК-56М-У42 при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0.5 см. Пробы отбирали с ин

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком