УДК 577.171.4
БИОГЕНЕЗ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ДЕЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКАХ ЯЧМЕНЯ (Hordeum vulgare L.)
© 2013 г. O. В. Евдокимова*, Л. Ф. Кабашникова, Г. Е. Савченко
Институт биофизики и клеточной инженерии НАНБеларуси, 220072, Беларусь, Минск, ул. Академическая, 27;
*электронная почта: ewdokimova@inbox.ru Поступила в редакцию 18.05.2012 г.
Изучали превращение форм протохлорофиллида в этиолированных проростках ячменя (Hordeum vulgare L.) и биогенез фотосинтетического аппарата в зеленеющих 7-дневных проростках при инги-бировании энергетических процессов. Подавление электронного транспорта между фотосистемой 2 (ФС2) и ФС1 диуроном ингибировало функциональную активность ФС2, контролируемую по параметрам РАМ-флуориметрии, но не влияло на биосинтез хлорофилла и не снижало содержания ATP в ткани листа по сравнению с контролем. Ингибирование митохондриального транспорта электронов азидом натрия приводило к увеличению относительного содержания нефотоактивной формы протохлорофиллида в этиолированных проростках, к снижению содержания ATP, хлоро-филлов и каротиноидов и к полному подавлению функциональной активности ФС2 — в зеленеющих. Ингибитор гликолиза — фторид натрия, еще сильнее влиял на перечисленные параметры. Отмечена синхронность накопления хлорофиллов и каротиноидов в процессе зеленения во всех вариантах, кроме фторида натрия (коэффициент корреляции r — 0.98, 0.97, 0.97 и 0.47 при уровне значимости 0.01, 0.015, 0.015 и 0.27, соответственно для контроля, диурона, азида и фторида натрия). Изменение содержания хлорофиллов под влиянием ингибиторов положительно коррелировало с количеством ATP в ткани листа (для 24 ч зеленения r = 0.97 при уровне значимости 0.015). Совокупность полученных данных позволяет предположить, что в биогенезе фотосинтетических мембран при деэтиоляции проростков ячменя в основном участвуют источники ATP непластидного происхождения.
Ключевые слова: (де)этиоляция, хлорофиллы, каротиноиды, протохлорофиллид, пигмент-белковые комплексы, ингибиторы дыхания и фотосинтеза, ATP.
DOI: 10.7868/S0233475513010039
Хорошо известно, что осуществление многих биосинтетических процессов и поддержание структуры клетки невозможно без участия ATP и NADPH. В частности, ATP необходим как для синтеза тетрапиррольной части молекулы хлорофилла [1] и изопреноидных соединений — фитола и каротиноидов [2], так и для трансляции структурных белков фотосинтетических мембран и импорта белков, кодируемых ядерными генами, в хлоропласт [3]. Регуляция энергетического обеспечения биогенеза фотосинтетического аппарата является одной из важных и недостаточно изученных проблем физиологии, биохимии и мембранной биофизики растений, тесно связанной с механизмами взаимодействия внутриклеточных органелл.
В отсутствие фотосинтеза в этиолированных проростках поставщиком макроэргических соединений для всех происходящих в темноте процессов является, главным образом, дыхание. Его
роль должна сохраняться, по-видимому, вплоть до начала функционирования хлоропластной электрон-транспортной цепи. Пока неясно, могут ли (и насколько) митохондрии (^участвовать в энергетическом обеспечении синтеза фотосинтетических пигментов в функционально активных хлоропластах. Рассмотренные в обзоре Семихатовой [4] данные позволили сделать вывод, что для поддержания метаболизма хлоропла-стов в зеленых листьях в темноте недостаточно энергетических эквивалентов, произведенных хлоропластами, так как их собственные окислительные системы (пентозофосфатный и гликоли-тический циклы) не играют при этом сколько-нибудь существенной роли. Поэтому, по мнению автора, хлоропласты обеспечиваются энергией за счет митохондрий путем совместно действующих челночного переноса и аденилатного транслокатора.
Экспериментальные данные о роли дыхания непосредственно в процессе хлорофиллообразо-вания немногочисленны. Так, известно, что синтез пигментов у зеленой водоросли Golenkinia подавляется при ингибировании митохондриально-го транспорта электронов азидом натрия и цианидом, ATP-синтаз — динитрофенолом и в анаэробных условиях [5]. При этом подавление диуроном фотосинтеза у Clorella vulgaris и Golenkinia [5, 6], а также в этиолированных проростках ячменя [7] незначительно влияло на накопление хлорофилла. В первые часы зеленения этиолированных проростков овса обнаружено усиление дыхательной активности митохондрий и связанного с увеличением фосфорилирования ADP транспорта неорганического фосфата через внутреннюю мембрану митохондрий [8]. Сравнительный анализ протеома этиолированных и зеленеющих проростков риса свидетельствует о небольшом увеличении при освещении синтеза ферментов, вовлеченных в гликолиз и цикл три-карбоновых кислот [9]. Имеются также данные о повышении активности гликолитических ферментов пируваткиназы и NADP-зависимой гли-церальдегид-3-фосфат-дегидрогеназы на ранних этапах формирования хлоропластов при зеленении листьев гороха [10]. В контексте рассматриваемой проблемы гликолиз представляет интерес не только как путь бескислородного получения энергии, но и как источник углеродных "скелетов" (наряду с пентозофосфатным циклом и циклом трикарбоновых кислот), необходимых для синтеза почти всех природных соединений, в том числе аминокислот [11], порфиринов [12] и изо-преноидов [2].
Усиление митохондриального дыхания обнаружено и в период интенсивного накопления хлорофилла в зеленеющих проростках ряда высших растений [8, 13, 14]. В растениях пшеницы митохондрии локализовались при этом вблизи хлоропластов [13].
Разграничить вклад разных источников энергоснабжения в процесс хлорофиллообразования в какой-то мере можно при помощи направленного подавления отдельных процессов (дыхания, фотосинтеза, гликолиза) соответствующими ингибиторами [15]. Несмотря на то, что интерпретация получаемых результатов осложняется довольно широким спектром действия используемых веществ и их возможной неспецифичностью [16, 17], эти исследования могут дать представление о взаимодействии разных внутриклеточных компартментов в процессе биогенеза фотосинтетического аппарата. Для этого необходимо изучить реакцию растения по совокупности структурно-функциональных параметров фотосинтетического аппарата.
Целью данной работы являлось изучение формирования пигментного аппарата в зеленеющих на свету этиолированных проростках ячменя при
подавлении линейного фотосинтетического электронного транспорта, цитохромного дыхательного пути и гликолиза при помощи ингибиторов. Информация такого рода важна для расширения представлений о процессе внутриклеточной регуляции биогенеза фотосинтетического аппарата в постэтиолированных проростках, которые обычно используются для изучения сугубо внутрипластидных мембранных процессов (последовательных стадий сборки фотосинтетического аппарата и мембранной системы хлоропластов) [18], либо чисто фоторегуляторных его аспектов [19].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 7-дневные этиолированные проростки ячменя (Hordeum vuigare L., сорт Гонар), выращенные в темноте при температуре +22°С (±2°С). Срезанные листья помещали в темноте на растворы ингибиторов или воду (контроль) и переносили на полихромый свет (интенсивность 30 мкмоль • м-2 • с-1) разной продолжительности. Гликолиз подавляли 50 мМ фторидом натрия, цитохромный путь — 5 мМ азидом натрия, а фотосинтез — 0.1 мМ диуроном [20]. Выбор концентраций ингибиторов обоснован по ходу описания и обсуждения результатов.
Содержание фотосинтетических пигментов в ацетоновых экстрактах из тканей листа определяли по [21]. В связи с неравномерной потерей влаги листьями при инкубации на разных ингибиторах содержание пигментов пересчитывали на сухую массу. О состоянии системы внутренних мембран этиопластов и пигмент-белковых комплексов фотосистем фотосинтеза судили по низкотемпературным спектрам флуоресценции листьев [22], которые регистрировали на спектро-флуориметре Solar CM 2203 (Беларусь). Функциональное состояние фотосинтетического аппарата in vivo оценивали по параметрам флуоресценции хлорофилла а, измеренным с помощью флуориметра PAM 210 (Walz, Германия) [23].
Содержание ATP в гомогенатах из листьев определяли биолюминесцентным методом [24], используя люминометр TD-20/20 (Turner Biosistems, США) и набор реагентов, произведенных фирмой Люмтек (Россия). ATP экстрагировали из предварительно растертых в жидком азоте тканей листа хлорной кислотой (0.83 М) [25]. Содержащие ATP супернатанты, отделенные от осадка тканей центрифугированием, смешивали с 1 М трицином (4 : 1), нейтрализовали 4 М KOH до рН 7.4 и разбавляли до одинакового объема раствором HEPES/KOH (рН 7.75), содержащим 0.48 мМ EDTA.
Все опыты выполняли как минимум в трех биологических повторностях. Статистическую обработку данных проводили по [26]. На графи-
ках приведены средние значения из биологических повторностей и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показано изменение содержания хлорофиллов и каротиноидов в зеленеющих листьях в пересчете на сухую массу. Видно, что скорость синтеза хлорофилла и уровень его накопления к 24 ч освещения не зависели от действия ди-урона, но снижались под влиянием азида натрия и в еще большей степени — после инкубации листьев на растворе фторида натрия. В последнем случае в синтезе хлорофиллов практически наблюдалась лаг-фаза протяженностью 24 ч на фоне разрушения каротиноидов, которое начиналось уже после освещения в течение 3 ч. Определение корреляционных связей между изменением содержания хлорофиллов и каротиноидов при зеленении в контрольных листьях, а также в вариантах с применением диурона и азида натрия указывает на синхронность в накоплении пигментов обеих групп (высокие значения коэффициентов корреляции в табл. 1). При деэтиоляции же листьев на растворе фторида натрия положительная корреляция между изменением содержания хлорофиллов и каротиноидов была незначительной (r = 0.47). По-видимому, в этих условиях возникают серьезные нарушения в биогенезе фотосинтетического аппарата, что свидетельствует, скорее всего, о своего рода метаболическом стрессе, в большей
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.