МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 2, с. 160-169
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.174.1:547.979.8
БИОГЕНЕЗ И ВОЗМОЖНОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТАВА
КАРОТИНОИДОВ ГЛАЗНОГО ПЯТНА У МУТАНТОВ МИКРОВОДОРОСЛИ СНЫМУВОМОтБ КЕтНЛЯВТП
© 2014 г. В. Г. Ладыгин1
Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 09.04.2013 г.
Детально исследовали биогенез ультраструктуры глазного пятна в хлоропластах мутантов одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas гвткагйШ. Установлено, что развитие ультраструктуры глазного пятна коррелирует с накоплением каротиноидов. В зависимости от их содержания, глазное пятно образует от 1 до 4 слоев липидно-каротиноидных глобул. Показано, что в глобулах глазного пятна накапливаются каротины. Впервые обнаружено, что у мутантов состав каротинов в глазном пятне может изменяться в зависимости от изменения их состава в мембранах хлоропластов.
Ключевые слова: Chlamydomonas reinhardtii, мутанты, хлоропласт, глазное пятно, ультраструктура, каротины, ксантофиллы.
DOI: 10.7868/S0026365614020141
Жгутиковые одноклеточные зеленые водоросли обладают фототаксическими способностями и образуют специфическую органеллу хлоропластов — глазное пятно (eyespot), часто называемое глазком или стигмой. Структурно оно содержит один или несколько (обычно 2—3) слоев гексагональных плотно упакованных богатых каротино-идами липидных глобул, локализованных внутри хлоропласта. У Chlamydomonas reinhardtii, как правило, оно располагается непосредственно под оболочкой хлоропласта, которая плотно прилегает к плазмомембране, но не сливается с ней [1—3]. В световой микроскоп глазное пятно или стигму можно видеть как желтую, оранжевую или светло-красную точку или пятно [1, 4]. Вначале полагали, что глазное пятно состоит только из 2-3-х слоев липидно-каротиноидных глобул. Однако в ходе дальнейших исследований было установлено, что липидные глобулы снаружи окружены белковыми мембранами [3], которые формируются в процессе развития глазного пятна внутри хлоропласта. Образование тилакоидов и глазного пятна обычно протекает почти одновременно. Каждый из 2—3 слоев липидно-каротиноидных глобул глазного пятна располагается на одном из тилакоидов [2, 5—7].
Ранее полученные нами пигментные мутанты Ch. reinhardtii представляют огромную ценность,
1 Автор для корреспонденции (e-mail: ladyginv@rambler.ru ).
как для идентификации фоторецепторных пигментов, так и для анализа структуры и функции глазного пятна [8, 9].
В одной из статей мы обратили внимание на очень интересный факт, что область максимальной спектральной чувствительности фототаксиса для глазного пятна мутанта СС1101 еу, mt(—) была смещена в коротковолновую часть длин волн в сравнении со штаммом дикого типа, что указывало на комплексное сочетание спектров поглощения фоторецептора глазного пятна и фотосинтетических пигментов, включенных в фотоориентацию [10]. Эти данные позволили нам предположить, что смещение максимума фототаксиса может быть обусловлено изменениями состава каротиноидов как в мембранах хлоро-пластов, так и в глобулах глазного пятна. Нас заинтересовал вопрос: может ли изменяться у мутантов состав каротиноидов глазного пятна, так же как и в мембранах хлоропластов? С целью проверки этого предположения, мы провели исследования состава пигментов глазного пятна на серии мутантов ^. reinhardtii, с измененным составом каротиноидов в мембранах хлоропластов, полученных нами ранее [9].
В данной работе было поставлено две задачи: 1 — изучить биогенез глазного пятна от образования первых глобул до развития максимально структурированной органеллы; 2 — установить состав ка-ротиноидов в глобулах глазного пятна исходного
дикого штамма и впервые с помощью мутантов доказать возможность экспериментального изменения их состава. Обе задачи можно было решить только с использованием пигментных мутантов от белых до темно-зеленых, в первом случае, а также мутантов с измененным составом кароти-ноидов в мембранах хлоропластов во втором. Наличие большого набора обоих типов мутантов [9] позволило нам решить обе задачи. Мы установили все этапы развития глазного пятна и впервые показали возможность экспериментального изменения состава каротиноидов в глобулах глазного пятна у мутантов Ch. reinhardtii.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В нашей работе объектами исследования служили штаммы одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang. дикого типа К(+) и мутантов: белого Б-1, не накапливающего никаких пигментов; желтого Ж-4, содержащего только каротиноиды; светло-зеленого С-41, с высоким содержанием дзета-каротина; зеленого не-фотосинтезирующего А-90, с высоким содержанием альфа-каротина и темно-зеленого Т-8, содержащего в 2—3 раза больше пигментов, чем клетки дикого типа [9].
Для экспериментов все штаммы выращивали в течение 4—5 сут на ацетатной агаризованной среде [8] при температуре 23—25°С и круглосуточном освещении люминесцентными лампами ЛБ-40 (Россия) при освещенности 1000—3000 лк.
Для получения глобул глазного пятна и фрагментов мембран хлоропластов клетки суспендировали в среде, содержащей 0.3 М сахарозу, 0.05 М трис-HCl, 0.01 М MgCl2, pH 7.5, и разрушали при температуре 4° С ультразвуком на установке УЗДН-1 (Россия) путем двукратного озвучивания по 20 с при частоте 15 кГц и силе тока 0.2 А. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 1500 g (3000 оборотов) в течении 5 мин на центрифуге ЦУМ-1 (Россия). Полученные из на-досадочной части фрагменты хлоропластов промывали в 0.05 М трис-HCl и 0.001 M EDTA, pH 8 и осаждали центрифугированием при 14000 g в течение 20 мин. Затем для разделения липидно-каротиноидных глобул глазного пятна и фрагментов мембран хлоропластов мы проводили в градиенте плотности сахарозы 0.5 : 1.0 : 1.5 : 2.0 М повторное центрифугирование при 14000 g в течение 20 мин. Фракция глобул глазного пятна (фракция 1) выявлялась в виде желтой или оранжевой полосы на границе между зонами 0.5 М и 1.0 М растворов сахарозы. Желтую полосу в обоих случаях мы аккуратно собирали пипеткой в отдельную пробирку, а затем использовали для биохимических, спектральных и электронно-микроскопических исследований.
Количественное содержание хлорофиллов и каротиноидов определяли спектрофотометриче-ски с использованием спектров поглощения 100% ацетоновых экстрактов [11].
Качественный состав каротиноидов анализировали методами бумажной и тонкослойной хроматографии [12, 13]. Полосы индивидуальных каротинов экстрагировали хлороформом, а полосы индивидуальных ксантофиллов — 96% этанолом. Экстракты каротиноидов анализировали спектро-фотометрически, используя спектры поглощения и их вторые и четвертые производные, полученные на спектрофотометре Shimadzu-UV-160 или Нь 1асЫ-557 (Япония).
Для электронно-микроскопических исследований глазного пятна целых клеток или выделенных из него липидно-каротиноидных глобул мы использовали 2.5% глютаровую фиксацию с последующей фиксацией раствором 1% 0804 или без него. Образцы обезвоживали в серии 20—100% растворов этанола и 100% ацетона и заливали в ЕР0^812. После полимеризации образцов срезы получали на микротоме LKB (Швеция) и просматривали их с помощью микроскопа JEM-7А (Япония) [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Биогенез ультраструктуры глазного пятна. Благодаря способности к темновому синтезу хлорофилла и каротиноидов, в хлоропластах клеток дикого типа СИ. гвткаМШ, всегда наблюдается хорошее развитие мембранной системы и глазного пятна, как на свету, так и в темноте. Поэтому, для того чтобы изучить различные этапы формирования глазного пятна и мембран хлоропластов, необходимо было искусственно блокировать на ранних этапах биосинтез пигментов. С этой целью методом мутагенеза нами были получены белые, желтые, светло-зеленые и темно-зеленые мутанты [8, 9].
С помощью белого мутанта Б-1, не содержащего ни хлорофилла, ни каротиноидов, удалось обнаружить самые первые этапы начала формирования глазного пятна. Так у мутанта Б-1 было обнаружено глазное пятно, состоящее всего из двух-трех липидно-каротиноидных глобул (рис. 1а), а у светочувствительного Б-3 — почти весь первый ряд глобул (рис. 1б).
Мы получили три типа желтых мутантов. Мутант Ж-1 — желтый в темноте и зеленеющий на свету подобно высшим растениям. Мутант Ж-3 — зеленый в темноте и фенотипически желтый на свету. Этот мутант терял хлорофилл на свету только при доступе О2. При посеве же иглой уколом внутрь столбика агара, мутант Ж-3 и на свету оставался зеленым, т.е. фотодеструкция и обесцвечивание были только при доступе О2 на свету.
& ЩЁ
"л
щ • с^'Жщ!
Рис. 1. Ультраструктурная организация глазного пятна на поперечных срезах в хлоропластах мутантов: белого Б-1 (а), белого светочувствительного Б-3 в темноте (б) и желтого Ж-4 на свету (в). Увеличение: Х80000.
Мутант Ж-4 постоянно был желтым, как на свету, так и в темноте [2, 9]. Исследование желтых мутантов показало, что степень развития глазного пятна четко корелирует с содержанием каротиноидов. Наличие или отсутствие хлорофилла и соответствующая степень развития мембранной системы в меньшей степени влияли на формирование глазного пятна. Практически во всех вариантах в хлоропластах желтых мутантов мы наблюдали достаточно хорошо развитое глазное пятно, как правило, состоящее из двух рядов глобул (рис. 1в). У них наблюдали только начальные этапы формирования тилакоидов.
В группе светло-зеленых мутантов с различным содержанием и соотношением хлорофиллов "а" и "b", но накапливающих практически то же самое количество каротиноидов, что и у желтых мутантов, мы наблюдали близкий уровень развития глазного пятна, но с хорошо развитыми тила-коидами (рис. 2а).
В клетках дикого типа К(+), как правило, наблюдалось формирование глазного пятна, состо-
(в)
Рис. 2. Ультраструктурная организация глазного пятна на поперечных срезах в хлоропластах светло-зеленого мутанта С-48 (а), клеток дикого типа К(+) (б) и мутанта Т-8 (в) после глутар-осмиевой фиксации. Увеличение: Х80000.
ящего из двух-трех рядов липидно-каротиноид-ных глобул, в зависимости от накопления пигментов (рис. 2б).
Однако у темно-зеленог
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.