ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 1, с. 72-81
УДК 616.9; 608.3:576.08; 57.085.23; 57.047
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ ВИРУСОВ В МАКРОФАГАХ
© 2013 г. Н. Г. Плехова**, Л. М. Сомова*, Н. В. Крылова*, Г. Н. Леонова*,
И. Н. Ляпун*, И. С. Смирнов**
*Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток, 690087 **Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, 690950 e-mail: pl_nat@hotmail.com Поступила в редакцию 27.09.2011 г.
Приведены результаты исследования метаболизма макрофагов при их заражении вирусами, различающимися по вирулентности. Для оптимизации оценки цитопатогенного действия вирусов на макрофаги предложен индекс реактивности клеток, который позволил выявить степень вирусного воздействия в условных единицах. Применение высокочувствительных методов определения функциональной активности макрофагов и выявление корреляционной связи между ее изменениями и морфологическими особенностями клеток можно отнести к объективным способам индикации не только репродукции вирусов, но и дифференцировки типов и степени их цитопатогенного действия.
DOI: 10.7868/S0555109913010157
Клетки моноцитарного происхождения в силу доступности методов их выделения, фракционирования и культивирования из периферической крови служат удобной моделью для изучения ряда общих цитофизиологических закономерностей. Функциональные свойства клеток моноцитарно-го происхождения настолько многообразны, что их неполноценность, как следствие или причина патологического процесса, со временем неизбежно формирует системное поражение организма, сопровождающееся иммунологической недостаточностью [1—3]. В процессе дифференцировки из промиелоцита в моноцит на поверхности плазматической мембраны образуются многочисленные рецепторы, принимающие участие в процессах адгезии, эндо- и фагоцитоза, межклеточного взаимодействия и восприятия регуляторных воздействий [4]. Популяция моноцитов у человека идентифицируется по экспрессии специфичного рецептора — кластера дифференцировки 14 (duster of differentiation — CD), а субпопуляции — по степени его выраженности на мембране, а также наличия дополнительного рецептора — CD16 [5]. Субпопуляция моноцитов, имеющая высокую степень экспрессии рецептора CD14 и отсутствие — CD16, относится к "классическим", составляющим у здоровых взрослых людей 90—95% от общего числа моноцитов, а субпопуляция с экспрессией CD16 (CD14+, CD16+) - к "провоспалительным" [6].
Система мононуклеарных фагоцитов филогенетически относится к древней линии защиты
организма. На каждой эволюционной ступени видов от простейших одноклеточных до млекопитающих выявляются клетки, способные к фагоцитозу [7]. Среди представителей позвоночных не выявлено существенных различий в характеристиках фагоцитирующих клеток, что определяет эти клетки как объекты для постоянного воздействия различных инфекционных агентов, в том числе вирусов. При длительном сосуществовании фагоцитов и вирусов возникают условия для адгезии вирусных частиц к поверхности макрофагов. Показано, что в процессе прикрепления вирусов, например флавивирусов — Денге и клещевого энцефалита и полиовируса, принимает участие гепарансульфатный протеогликан — рецептор макрофагов [8—11].
В зависимости от проявляемых свойств инфекционного агента происходит активация клетки. Прямое противовирусное действие макрофагов реализуется при активации следующих основных механизмов микробицидности: кислородзависи-мое, кислороднезависимое и нитроксидобразую-щее. Кислороднезависимые механизмы активируются в процессе слияния фагосом и лизосом, а кис-лородзависимые механизмы играют ведущую роль в деструкции объекта фагоцитоза. Этот процесс происходит при стимулировании комплекса НАДФ-оксидазы, также известной как фагоцитарная окси-даза или оксидаза кислородного взрыва. При ее участии происходит образование активных форм
кислорода: супероксидного анион-радикала О2-,
пероксида водорода Н2О2, гидроксильного радикала ОН'- и др. Исследования недавних лет показали, что в стимулированных вирусами и провос-палительными цитокинами макрофагах, наряду с продукцией активных метаболитов кислорода, происходит образование оксида азота [12, 13]. Оксид азота (N0) — это газовая молекула со свойствами свободного радикала, имеющая неспарен-ный электрон, что придает ей высокую активность к реакции с кислородом, супероксидным анион-радикалом и металлами гемсодержащих и негемовых белков [14]. В макрофагах образование N0 осуществляется двумя путями — нитроксид-синтазным, при окислении аминокислоты L-ар-гинин в присутствии фермента синтазы оксида азота, и нитритредуктазным, действующим в условиях дефицита кислорода при активации нитритредуктазных систем, связанных с гемсо-держащими белками — гемоглобином, миогло-бином, цитохромоксидазой и др. [15]. Таким образом, нитроксидобразующая активность моноцитов (макрофагов) малоизученная при вирусных инфекциях, представляет определенный интерес, в точки зрения этих клеток в защите организма.
Способность вируса вызывать специфическую морфологическую и функциональную патологию зараженных им клеток, культивируемых вне организма, называется цитопатогенностью. Различают 3 типа цитопатогенного эффекта вирусов: цитоли-тический, трансформирующий, индуктивный [7]. Цитолитический эффект характеризуется общей деструкцией клетки, которой предшествуют морфологические изменения клеточных органелл и разрушение митохондрий. При трансформирую -щем эффекте зараженная вирусом клетка приобретает способность к неограниченной пролиферации. Индуктивный цитопатический эффект характеризуется способностью вируса стимулировать инфицированные клетки к продукции цитокинов.
Феномен цитопатического эффекта используют для диагностики, идентификации и титрования вирусов в культуре клеток. При сравнении в строго контролируемых условиях нескольких штаммов вирусов их цитопатогенное действие может иметь количественное выражение, а его степень измеряется в количестве вирусных частиц, необходимых для заражения культуры клеток. При поддержании штаммов вирусов в лабораторных условиях их свойства часто изменяются как в сторону усиления, так и ослабления, и определение цитопатогенных свойств вирусов приобретает особенный смысл, связанный с постановкой различных научных экспериментов.
Цель работы — сравнительное исследование особенностей метаболизма макрофагов при заражении вирусами, различающимися по степени
вирулентности, и морфологических изменений этих клеток.
МЕТОДИКА
Первичную культуру макрофагов получали из перитонеальной полости беспородных белых мышей. Для экспериментов использовали концентрацию 2 х 106 кл./мл в среде состава института памяти Рузвелл Парка (Roswell Park Memorial Institute medium — RPMI) (фирма "Sigma") с 5% эмбриональной бычьей сывороткой (фирма "ICN"). Суспензию клеток разносили по 100 мкл в лунки иммунологического плоскодонного планшета. После 40 мин инкубации в термостате при 37°С в смешанной атмосфере с присутствием 5% СО2 неадгезированные клетки дважды отмывали теплой средой RPMI и в 200 мкл среды, включающей 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мкм глутамина и 0.2 мкм гентамицина, оставляли на 3 сут для окончательной дифферен-цировки клеток.
Для заражения клеток был взят высоковирулентный штамм "Primorye-73" (Р-73) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), выделенный из мозга умершего больного клещевым энцефалитом, и два штамма Primorye-202 и Primorye-69 (Р-202 и Р-69), выделенные из крови больных лихорадочной формой заболевания. Также использовали вирусы сем. Picornaviridae: вакцинный штамм LSc2ab вируса полиомиелита типа 1 (полиови-рус); кишечный цитопатогенный вирус-сирота человека (Enteric Cytopathic Human Orphan — ECHO) типа 11, вариант В, штамм "Каримов", сибирский, увеатропный и вирус Коксаки В типа 1, прототипный штамм Conn. 5 (вирус Коксаки В1). Эти вирусы отличались по степени цитопатоген-ности, определенной на чувствительных к ним перевиваемых культурах клеток. Наиболее цито-патогенным был полиовирус (LD100), затем вирус Коксаки В1 (LD70) и последний по степени цито-патогенности — энтеровирус ЕСНО11 (LD10). В экспериментах использовали вируссодержащую культуральную жидкость перевиваемых клеток, зараженных вирусами, содержащую 2 lg титра ци-топатогенного действия при 50% гибели клеток (ТЦД50). Инкубацию клеток с вирусами проводили в течение 60 мин, после чего для удаления не-адгезированных вирусных частиц монослой клеток промывали дважды средой RPMI и продолжали инкубировать до 24 ч.
Оценка динамики накопления вирусного антигена в клетках проводилась непрямым методом флуоресцирующих антител (нМФА). Для этого, монослой клеток фиксировали в 100° охлажденном метиловом спирте при минус 20°С в течение 30 с, с целью определения вирусного антигена на фиксированные клетки наслаивали поликло-
нальную сыворотку иммуноглобулинов мыши против использованных для заражения макрофагов вирусов в разведении 1 : 64 и объеме 5—20 мкл. Неспецифическое свечение исключалось путем инкубирования образцов в течение 1 ч в 3% растворе альбумина на основе рабочего буфера. Препараты выдерживали во влажной камере в течение 30 мин в термостате при 37°С, потом промывали рабочим буферным раствором с твином. В качестве флуоресцирующей сыворотки для выявления антигенов вирусов использовали Zenon Labeling Kit Alexa Fluor 546 (фирма "Sigma") против иммуноглобулина мыши IgGl.
Образцы просматривали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (ЛСКМ). Для измерений использовали водноим-мерсионный объектив (х40) C — Plan-Apochromat (числовая апертура 1.4), обеспечивающий разрешение около 0.3 мкм в плоскости объектива и около 0.6 мкм вдоль оптической оси объектива при сканирующем возбуждении. Размер конфокальных изображений составлял 1024 х 1024 вок-селей, а время измерения одного изображения — около 25 с. Для регистрации в клетках меченного вирусного антигена использовали возбуждение 543 нм (~20 мкВт на образце, 100%). Световое излучение клеток проходило через одно из трех ди-хроичных зеркал: NT 80/20, HFT 545; после чего, с помощью дихроичного зеркала
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.