ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 437-441
УДК 577.158+581.19
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ НА СТАДИИ ЗАВЯЛИВАНИЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ЧЕРНОГО ЧАЯ
© 2014 г. Н. Т. Омиадзе*, Н. И. Мчедлишвили*, Х. Н. Родригез-Лопез**, М. О. Абутидзе*, Т. А. Садунишвили*, Н. Г. Пруидзе*
*Институт биохимии и биотехнологии им. С.В. Дурмишидзе Аграрного университета Грузии, 0159, Тбилиси, Грузия
**Университет Мурсии, 30100, Мурсия, Испания e-mail: nino.omiadze@agruni.edu.ge Поступила в редакцию 9.12.2013 г.
Определены молекулярные массы и некоторые свойства множественных форм фенолоксидазы листьев чая и еще 4 других многолетних растений. Показано, что высокомолекулярные и низкомолекулярные множественные формы фенолоксидазы различались субстратной специфичностью. Низкомолекулярные формы фермента большей частью проявляли гидроксилирующую активность, высокомолекулярные — катехолоксидазную.
Установлено, что на стадии завяливания при производстве черного чая происходит образование именно высокомолекулярных форм фенолоксидазы, обладающих преимущественно катехолокси-дазной активностью, участвующей в подготовке основных для технологического процесса окислительных преобразований, определяющих качественные показатели готовой продукции.
Б01: 10.7868/80555109914040266
Процессы ферментации лежат в основе производства продукции во многих отраслях пищевой промышленности. Очень часто при этом фермент фенолоксидаза (КФ 1.14.18.1, монофенол, диок-сифенилаланин: О2-оксидоредуктаза) играет основную роль.
Производство чая, вина, табака, какао и др. — самые древние процессы, которые практически полностью определяются окислительными преобразованиями, протекающими под действием фенолоксидазы [1—5]. Во время технологической переработки сырья происходит повреждение тканей, нарушается целостность клетки и фермент начинает воздействовать на фенольные субстраты. В результате функционирования фенолокси-дазной системы в этом процессе формируется характерный вкус продуктов, аромат и цвет.
Качество черного чая и вид продукции также определяется эффективностью действия фено-локсидазы, глубиной окислительных преобразований различных соединений [3, 6—9]. Окислительные превращения фенольных соединений начинаются с процесса скручивания [3, 10, 11] и полностью проявляются во время ферментации. В результате формируются главные качественные показатели продукции, которые фиксируются в процессе сушки. При сушке чая происходит также и дальнейшее совершенствование аромата чая. Все эти процессы уже давно и довольно глубоко изучены [3, 10, 12, 13], но какова роль завялива-
ния — самого первого технологического процесса чайного производства, во время которого происходит потеря влаги с 76 до 60—62%, и какие биохимические процессы протекают на этой стадии не было понятно. Некоторые авторы считают, что завяливание — это процесс подготовительный, необходимый для получения гармонично сочета-ющийхся вкусовых и ароматических свойств продукции [10]. Другими авторами показано не только на чайном листе, но и на многих других растительных объектах, что наступление водного дефицита в ткани листа приводит к повышению активности многочисленных ферментов растительного организма. В ходе завяливания по мере удаления воды уменьшается синтезирующая способность и усиливается гидролитическая активность инвертазы, протеазы, амилазы, что приводит к усилению гидролитических процессов и повышению экстративности чая [3, 14]. Завяливание имеет большое значение для равномерного протекания окислительных процессов при ферментации [10, 14]. Все попытки получения высококачественной продукции черного чая, исключая процесс завяливания, завершились неудачей.
Цель работы — выяснение биохимических процессов сути процесса завяливания.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. Для работы были использованы местные сорта чайного растения
438
ОМИАДЗЕ и др.
мл
Рис. 1. Профиль элюции с колонки сефадекс G-200 гидроксилирующей (I) и катехолоксидазной (II) активности фенолоксидазы чайного листа. Молекулярные массы: 250000 (1), 118000 (2), 58000 (3), 41000 (4), 28000 (5).
Рис. 2. Профиль элюции с колонки ультрагель АСА-34 гидроксилирующей (I) и катехолоксидазной (II) активностей фенолоксидазы из листа киви. Молекулярные массы: 250 000 (1), 70 000 (2), 42000 (3), 28000 (4).
(Camellia sinensis L.), также листья киви (Actinidia deliciosa), плоды яблок (Mallus domestica) сорта "Кеху-ра", зеленые околоплодники ореха (Juglansregia L.) и гребни виноградной лозы (Vitis vinifera).
Реактивы. В работе использовали: пирокатехин и п-крезол ("Лабтех", Россия) с предварительной очисткой методом возгонки в вакууме, полиамид ("Woelm Pharma" Германия), твин-80 ("Serva" Германия), аскорбиновую кислоту ("Reanal" Венгрия), а также белки-метчики для определения молекулярной массы ("Pharmacia", Швеция).
Выделение фенолоксидазы. Растительный материал тщательно измельчали в жидком азоте. К измельченному материалу добавляли полиамид (1 : 1) и 0.05 М цитратно-фосфатный буфер (рН 6.0), содержащий 0.03 М аскорбиновой кислоты и 0.03 М NaHC03 и гомогенизировали в течение 3—5 мин (соотношение измельченного материала к буферной смеси 1 : 15). Гомогенат центрифугировали 40 мин при 3000 g. В супернатант добавляли сернокислый аммоний до 95% насыщения, осадок отделяли центрифугированием 20 мин при 10 000 g. Полученный осадок перерастворяли в буфере (см. выше), низкомолекулярные примеси удаляли из раствора методом гель-фильтрации на сефа-дексе G-25 ("Pharmacia", Швеция). В результате получали суммарный препарат фенолоксидаз, который проявлял активность катехолоксидазы, а также катализировал реакцию гидроксилирова-ния монофенолов в о-дифенолы.
При выделении указанных ферментов из свежего сырья зеленого околоплодника ореха (Juglans regia L.) и гребней виноградной лозы (Vitisvinifera) во время экстракции в буферный раствор добавляли твин-80, так как в этих объектах фенолоксидазы находятся в основном в связанном с клеточными структурами виде.
Определение гидроксилирующей активности фенолоксидазы. Активность определяли по скорости окисления п-кумаровой кислоты или п-крезола в присутствии восстановителя аскорбиновой кислоты или пролина, как описано в работе [15, 16]. Измерения проводили против контрольной смеси, содержащей те же компоненты кроме ферментного раствора, который заменяли соответствующим количеством дистиллированной воды. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре СФ-26 при 530 нм.
Определение активности катехолоксидазы. Активность определяли спектрофотометрическим методом при 420 и 430 нм с использованием в качестве субстрата пирокатехина и пирогаллола соответственно, как описано в работе [17].
При проведении процесса завяливания 2— 3-листные побеги чая (на 1 повторность) выдерживали 3 ч при температуре 45—47°C.
Белок определяли с реактивом амидо черный [18, 19].
Молекулярную массу фенолоксидаз определяли методом гель-фильтрации на колонках с сефа-дексом G-200 [20] ("Pharmacia", Швеция), и ультрагелем ACA 34 ("LKB", Франция).
Статистическая обработка представленных данных проводилась, как описано [21].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения биохимических процессов, происходящих при завяливании растительного материала, были получены некоторые характеристики основного для чайного производства фермента — фенолоксидазы, ее гидроксилирующей и катехо-локсидазной активности, ответственной за основные преобразованиями фенольных соединений,
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ НА СТАДИИ ЗАВЯЛИВАНИЯ
439
A
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0
0.05
70000 {
(a)
A
10 20 30 40 50 60
(б)
70000 135000 I 55000 t t
Ii
A
10 20 30 40 50
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.1
(в)
142000
10 20 30 40
50 мл
Рис. 3. Профиль элюции с колонки ультрагель АСА-34 фенолоксидаз с гидроксилирующей (I) и катехолоксидазной (II) активностями из гребней виноградной лозы (а), зеленого околоплодника ореха (б) и плодов яблони (в).
определяющие качественные показатели продукции.
Фенолоксидаза, выделенная из листьев чая, была представлена множественными формами (рис. 1). Как видно из результатов гель-фильтрации, множественные формы фермента различались субстратной специфичностью. Высокомолекулярные фенолоксидазы характеризовались ка-техолоксидазной активностью, катализировали окисление катехинов, но не действовали на монофенолы (п-крезол, п-кумаровая кислота). Полученные результаты подтверждаются исследованиями и других авторов [22]. Низкомолекулярные формы фенолоксидазы проявляли сравнительно низкую катехолоксидазную активность и с высокой скоростью катализировали гидроксилирова-ние монофенолов в о-дифенолы.
Такую же субстратную специфичность проявляли и фенолоксидазы из других растительных материалов. Изучены молекулярные массы фенолокси-даз листьев киви, зеленого околоплодника ореха, плода яблок, гребней виноградной лозы. Фенолок-сидазы из этих объектов были также представлены множественными формами. Для киви, наряду с низкомолекулярными формами, обнаружены и
высокомолекулярные (250000, 118000 кДа) фенолоксидазы (рис. 2). Для зеленого околоплодника ореха, гребней виноградной лозы и плодов яблок характерно наличие только низкомолекулярных форм (<70000 кД) фенолоксидаз (рис. 3) с молекулярными массами 70000, 55000, 42000, 35000, 28000, 21000 кД.
Исследование зависимости гидроксилирую-щей активности фенолоксидаз листьев чая, киви, зеленой кожуры ореха и гребней виноградной лозы от концентрации фермента, показало, что активными являются диссоциированные формы (рис. 4). Максимальная гидроксилирующая активность отмечалась при низких концентрациях белка (рис. 4). Увеличение концентрации белка вызывало уменьшение гидроксилирующей активности этих фенолоксидаз. При исследовании катехолоксидазной активности фенолоксидаз (рис. 4б, в, 2) была отмечена положительная корреляция между концентрацией фермента и его активностью, что наглядно указывало на то, что эту активность проявляли ассоциированные формы фермента.
Таким образом, можно заключить, что гидрок-силирующую активность преимущественно про-
Рис. 4. Зависимость активности (%) фенолоксидазы с гидроксилиру
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.