НЕФТЕХИМИЯ, 2013, том 53, № 1, с. 64-69
УДК 579.873.6.017.7.
БИОХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ВЫСОКОВЯЗКОЙ НЕФТИ АБОРИГЕННОЙ ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРОЙ
© 2013 г. Д. А. Филатов, Е. В. Гулая, Л. И. Сваровская, Л. К. Алтунина
Институт химии нефти Сибирского отделения РАН, Томск E-mail: Filatov@ipcp.tsc.ru; sli@ips.tsc.ru Поступила в редакцию 11.05.2012 г.
В лабораторных условиях исследовано влияние высоковязкой нефти Усинского месторождения на оксигеназную активность аборигенной почвенной микрофлоры. После периода адаптации, микроорганизмы приспосабливаются к углеводородам высоковязкой нефти и скорость биохимического окисления возрастает. За 60 суток эксперимента утилизация нефти составила 50%. Анализ остаточных углеводородов нефти методом ИК-спектрометрии показал появление полос поглощения в области 1070, 1165, 1730, 1270, 3300 см-1, что указывает на присутствие большого количества кислородсодержащих соединений и свидетельствует о процессах окисления углеводородов нефти. Хроматомасс-спектрометрический анализ подтвердил интенсивность биодеструкции: утилизация насыщенных ациклических УВ составила 77.5%, циклических — 99.2%, алкилбензолов — 99%, биоароматических — 97—99%, триароматических — 96% и полиароматических — 97%.
Ключевые слова: высоковязкая нефть, оксигеназная активность микроорганизмов, биодеструкция, углеводороды.
Б01: 10.7868/80028242113010048
Характерной особенностью современной нефтедобычи является увеличение доли трудноизвле-каемых запасов, к которым относятся, в частности, тяжелые и высоковязкие нефти с вязкостью 30 мПа с, или 35 мм2/с, и выше [1—3]. Запасы таких нефтей по оценкам специалистов составляют не менее 1 трлн. т. Эти нефти будут основным сырьем энергетики XXI века. В промышленно развитых странах они рассматриваются не только как резерв добычи нефти, но и в качестве основной базы развития на ближайшие годы [2]. В России трудно извлекаемые нефти составляют более 60% в общем объеме запасов нефти [4]. Несовершенство технологий добычи, транспортировки, переработки и хранения нефти приводит к ее значительным потерям и в той или иной мере — к загрязнению атмосферы, почвы, вод, а также к негативному воздействию на человека, флору, фауну [5].
Целый ряд современных биотехнологий очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами предусматривает процесс микробной интродукции или активизации эндемичной (почвенной) микрофлоры [6, 7]. Интенсивность процессов самоочищения почвы определяется наличием в ней углеводородокисляющей микрофлоры, способной к биодеградации нефти и нефтепродуктов. Эта таксономически разнооб-
разная группа микроорганизмов, представители которой широко распространены в природе, способна окислять любые органические соединения нефтяного ряда, благодаря чему углерод нефти может вовлекаться в биохимический цикл. Утилизация нефтепродуктов, загрязняющих почву, в большой степени зависит от динамики численности, видового состава почвенной микрофлоры и ее углеводородокисляющей активности [8]. Высоковязкие нефти считаются труднодоступными для утилизации микроорганизмами, поэтому целью данной работы являлось изучение процессов биохимического окисления углеводородов (УВ) высоковязкой нефти Усинского месторождения аборигенной почвенной микрофлорой.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объект исследования — нефть Усинского месторождения, обладающая аномальными неньютоновскими свойствами, относится к классу "тяжелых" высоковязких нефтей со значительным содержанием смол, асфальтенов и серы (1.98— 2%). Пластовая температура 25—30°С. Коллекторы приурочены к отложениям среднего и верхнего девона и нижней перми. Физико-химическая характеристика нефти Усинского месторождения представлена в табл. 1.
Таблица 1. Физико-химические свойства нефти Усин-ского месторождения
Параметр, размерность Значения
3 Плотность, кг/м3, при 20°С 0.9667
Вязкость, мПа ■ с, при 20°С 5677
Температура застывания, °С -22.5
Молекулярная масса, а. е. м. 365
Состав нефти:
твердые парафины 1.24
н-алканов 1.27
ароматические УВ 65.79
смолы 21.5
асфальтены 10.2
Компонентный анализ органических соединений исходной и биодеградированной нефтей проводили методом хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС).
Работа выполнена с использованием магнитного хроматомасс-спектрометра DFS фирмы "Thermo Scientific" (Германия) с кварцевой капиллярной хроматографической колонкой фирмы "Thermo Scientific" внутренним диаметром 0.25 мм, длиной 30 м, неподвижной фазой TR-5MS. Методом ГХ-МС в нефтях идентифицированы такие углеводороды, как алканы, алкилбензо-лы (АБ), нафталины (Н), бифенилы (БФ), флуоре-ны (ФЛ), фенантрены (Ф), флуорантены (ФЛУ), бензфлуорантены (БФЛУ), пирены (ПИР) и другие циклические соединения.
Загрязнение почвы проводили искусственно: почву, просеивали через сито, взвешивали и загрязняли нефтью в концентрации 50 г/кг. Применяли грунт на основе низинного торфа и биогумуса с высоким содержанием питательных веществ и микроорганизмов. В ходе опыта определяли численность почвенной микрофлоры и активность почвенных ферментов, принимающих активное участие в процессах деструкции углеводородов нефти. Численность клеток определяли методом посева на плотные агаровые среды [9]. Каталазную активность определяли газометрическим методом по скорости распада перекиси водорода, выраженной в мл О2 на 1 г почвы за мин. Активность дегидрогеназы, пероксидазы и поли-фенолоксидазы определяли фотоколориметрическими методами [10].
Продолжительность эксперимента 60 сут. Остаточное содержание нефти в почве определяли гравиметрическим методом. Для этого нефть из загрязненных образцов почвы экстрагировали хлороформом в аппарате Сокслета. Извлеченную нефть освобождали от хлороформа на роторном испарителе и взвешивали [11].
Изменение структурного состава нефти анализировали методом ИК-спектроскопии на спектрометре Фурье NIKOLET 5700 (FT-IR), Thermo Electron, США.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Начальный период (1—17 сут) культивирования микроорганизмов в нефтезагрязненной почве нефтью характеризуется снижением численности микроорганизмов от 3—4 млн. клет/г до 0.4— 0.7 млн. клет/г. Это связано с гибелью неустойчивых групп микроорганизмов, что происходит в результате токсического действия некоторых углеводородов нефти (алканы, циклоалканы, ароматические УВ) на почвенную микрофлору. То же самое происходит и с активностью почвенных ферментов, которая на 5-ые сут культивирования снижается в 1.5—2 раза (табл. 2). Через 15 сут после загрязнения почвы нефтью происходит перестройка микробиоценоза почвы, при которой преимущество получают углеводородокисляю-щая группа микроорганизмов, способная усваивать УВ нефти в качестве единственного источника углерода. Относительно долгий период адаптации, связан с тем, что высоковязкая нефть содержит много высокомолекулярных соединений, однако, микроорганизмы приспосабливаются, и скорость биохимического окисления возрастает. На рис. 1 показана динамика численности гетеротрофных бактерий в нефтезагрязненной почве, которые относятся к группе активных биодеструкторов и продуцентов биоПАВ. По ходу эксперимента видовое разнообразие микроорганизмов снижается, доминируют микроорганиз-
Таблица 2. Ферментативная активность почвы загрязненной нефтью Усинского месторождения
Ферменты Исходная Сутки опыта
5 15 30 60
Каталаза, мл/г Дегидрогеназа мг/г Пероксидаза, мг/г Полифенолоксидаза, мг/г 2.51 ± 0.25 0.31 ± 0.02 0.29 ± 0.03 0.16 ± 0.02 1.12 ± 0.15 0.12 ± 0.01 0.21 ± 0.01 0.09 ± 0.01 2.40 ± 0.22 0.30 ± 0.02 0.59 ± 0.04 0.15 ± 0.01 4.75 ± 0.32 0.41 ± 0.01 1.01 ± 0.03 0.37 ± 0.02 7.5 ± 0.24 0.78 ± 0.02 1.31 ± 0.05 0.59 ± 0.03
<ч о S '
т
и
Я
се
1-е
р
О
о
р
м
и
Контроль Опыт
700 600 500 400 300 200 100 0
<ч
о
т
и
се ^ ^ Л
рп
оо
О W Л 1-н
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Рис. 1. Динамика численности гетеротрофных бактерий в чистой (контроль) и загрязненной нефтью почве (опыт).
мы-деструкторы УВ нефти, принадлежащих к родам: Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Flavobacteri-um, Arthrobacter, Brevibacterium, Rhodococcus, максимальная численность которых возрастает в 40 раз относительно чистой почвы (рис. 1). Т.е. в контрольном варианте биохимическая активность микроорганизмов гораздо менее эффективна, чем в опытном.
Известно, что с окислительно-восстановительными процессами, происходящими при участии различных ферментов, связан распад нефтяных углеводородов в почве [6]. Ферменты представляют собой высоко специализированные катализаторы. Каждому живому организму присущ особый набор ферментов, благодаря чему, тот или иной организм обладает способностью усваивать те или иные вещества. Этим объясняется большая приспособляемость микроорганизмов к усвоению разнообразных углеводородов нефти и нефтепродуктов.
Важнейшими и широко распространенными у почвенных микроорганизмов деструкторами нефти являются дегидрогеназа, каталаза, полифено-локсидаза и пероксидаза. Дегидрогеназа принимает непосредственное участие в разложении УВ до СО2 и Н2О, а высокоактивный кислород, образующийся при участии каталазы, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах биодеструкции УВ. Фенолокси-дазы разлагают различные ксенобиотики и участвуют в окислении ароматических соединений нефти до хинонов и дальнейшей их конденсации в молекуле гумусовых веществ. К концу эксперимента активность всех исследованных ферментов возрастает в 2—4 раза по сравнению с исходной почвой, что свидетельствует о процессах биохимического окисления УВ (табл. 2).
Гравиметрический метод показал, что утилизация высоковязкой нефти за 60 сут составила
25 г/кг (50% от исходного загрязнения). Вероятно, остаточная нефть по химическому составу близка к битуму материнских пород (смолы, ас-фальтены, твердые парафины). Смолы и асфаль-тены относятся к высокомолекулярным неуглеводородным компонентам нефти. Структурный каркас смол и асфальтенов составляют высокомолекулярные полициклические ароматические структуры, состоящие из десятков колец, соединенных между собой гетероатомами S, О, N. Эти компоненты являются труднодоступными для микробиологического окисления.
Для ИК-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.