ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 2, с. 212-220
УДК 579:222:4
БИОКОНВЕРСИЯ С19- И С21-СТЕРОИДОВ РОДИТЕЛЬСКИМ И МУТАНТНЫМИ ШТАММАМИ Curvularia lunata
© 2010 г. В. В. Коллеров, А. А. Шутов, В. В. Фокина, Г. В. Суходольская,
С. А. Гулевская, М. В. Донова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН Пущино, Московская обл., 142290
e-mail: svkollerov@rambler.ru Поступила в редакцию 17.02.2009 г.
Изучена регио- и стереоспецифичность гидроксилирования 3-кето-4-ен-стероидов андростаново-го и прегнанового ряда культурой Curvularia lunata ВКМ F-644. Продукты трансформации выделяли колоночной хроматографией и идентифицировали методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии и 1НЯМР-спектроскопии. Показано, что С^-стероиды (андрост-4-ен-3,17-дион, андроста-1,4-ди-ен-3,17-дион, андрост-4-ен-9а-ол-3,17-дион) преимущественно подвергаются гидроксилирова-нию в положении 14а; среди минорных продуктов выявлены 6а-, 6Р-, 7а-гидроксипроизводные. При трансформации С21-стероидных соединений — кортексолона и его ацетилированных производных установлено, что введение ацетильного заместителя в положение 17 стероидного ядра молекулы кортексолона способствует селективному образованию 11р-гидроксипроизводных. Разработаны оригинальные методы получения протопластов, мутагенеза и селекции штаммов грибной культуры. Получен мутантный штамм М4 с повышенной 11р-гидроксилазной активностью в отношении 21-ацетата и 17а,21-диацетата кортексолона. Выход 11р-гидроксипроизводных при трансформации 17а,21-диацетата кортексолона (1 г/л) мутантным штаммом М4 составил 87%.
Микробиологическое гидроксилирование является эффективным методом получения фармацевтических стероидных соединений, химический синтез которых крайне сложен [1]. Дейтеромицет Curvularia lunata (и его телеоморф Cochliobolus luna-tus) отличаются высокой эффективностью в осуществлении введения гидроксильной группы в положение 11р прегнанов [2]. Реакция применяется при получении физиологически активных стероидных препаратов с противовоспалительной и антиаллергенной активностью [3], в том числе при промышленном получении гидрокортизона из кортексолона [2, 4]. Описано образование 14а-, 11а-, 15а-гидроксипроизводных при трансформации этим грибом андрост-4-ен-3,17-диона (АД) [5, 6].
Стероидные гидроксилазы мицелиальных грибов, как правило, представляют собой монооксиге-назные ферментные системы преимущественно микросомальной локализации, содержащие цито-хром P-450 (Цит P-450) в качестве терминальной оксидазы, связывающей субстрат, и флавопротеин НАДФН-Р-450-редуктазу для переноса электронов от восстановленного кофермента к Цит Р-450 [7—9]. Подобно другим ферментам суперсемейства Р-450-монооксигеназ, стероидные гидроксилазные системы низших эукариот, как известно, обладают широкой субстратной специфичностью in vivo. Введение гидроксильной группы в определенное положение, селективность процесса биотрансформации и его эффективность в значительной степени определя-
ются структурой стероидного субстрата. Важным критерием, определяющим положение гидроксильной группы, является наличие и структура боковой цепи при С-17. Так, культура Curvularia lunata активно гидроксилировала кортексолон и прогестерон в положении 11 ß, в то время как отсутствие боковой цепи в субстрате АД смещало его трансформацию данной культурой в сторону преимущественного 14а-гидроксилирования [2, 4—6, 10]. В другом случае мицелиальный гриб Phycomyces blakesleeanus гидроксилировал прогестерон с образованием смеси 7а-, 6ß-, 14а- и 15ß-гидроксипро-изводных, тогда как основными продуктами трансформации тестостерона (ТС) этой культурой являлись андрост-1,4-диен-3,17-дион (АДД) и 1(2)-дегидро-ТС [6].
Структурная модификация стероидного ядра путем введения различных функциональных заместителей является удобным инструментом для регуляции стерео- (положение а или ß) и региоспецифич-ности (положение при определенном атоме углерода в молекуле субстрата) процессов гидроксилирования. Например, замена при С-4 метильного заместителя на хлор приводила к смещению положения гидроксилирования производных ТС культурой Fusarium culmorum AM282: вместо аллильного 6ß-гидроксилирования наблюдалось преимущественное образование 15а-ОН-производного и переход 3-кето-4-ен- в 3ß-ОН-5-ен-группировку [11].
Наличие в структуре стероидного ядра дополнительных двойных связей также может приводить к изменению состава и соотношения продуктов гид-роксилирования. Так, при трансформации ТС культурой Absidia glauca наблюдали образование смеси 7а-, 11а- и 6р-гидроксилированных продуктов, в то время как наличие двойной связи в 1(2)-дегидро-ТС способствовало накоплению 6р-ОН-, 7р-ОН- и 15р-ОН-АД [12].
Селективность 11р-гидроксилирования может быть повышена с помощью мутагенеза с последующей селекцией наиболее активных штаммов. При этом в качестве маркера при отборе мутантов может быть использована устойчивость к кетоко-назолу — фунгициду азольной природы, ингибитору Цит P-450 [13]. Точечная мутация в гене, ответственном за синтез Цит P-450, может приводить к устойчивости к фунгицидам азольной природы, обусловленной суперэкспрессией мутантного гена [13, 14]. Однако мутагенез интактных клеток мицелия и селекция полученных мутантов, как правило, малоэффективны вследствие сложного строения клеточной оболочки и многоядерности мицелиаль-ных фрагментов [13]. Решением проблемы может быть использование при мутагенезе одноядерных протопластов.
Так, стабильные мутанты Curvularia lunata IM 2901, полученные обработкой ^метил^-нитро-N-нитрозогуанидином одноядерных протопластов с их последующей регенерацией, селективно гид-роксилировали кортексолон до гидрокортизона в отличие от родительского штамма [14]. Другой пример касается кетоконазолустойчивого мутанта Curvularia lunata КА-91, полученного при помощи УФ-облуче-ния протопластов, скорость накопления гидрокортизона у которого при трансформации 21-ацетата кортексолона была на 42% выше, чем у исходного штамма [13].
Цель работы — изучение регио- и стереоспеци-фичности гидроксилирования 3-кетостероидов ан-дростанового и прегнанового ряда родительским штаммом Сurvularia lunata ВКМ F-644, а также получение и изучение стероидтрансформирующей активности его мутантов.
МЕТОДИКА
Реактивы. Использовали прегн-4-ен-17а,21-ди-ол-3,20-дион (кортексолон), прегн-4-ен-11р,17а,21-триол-3,20-дион (гидрокортизон), андрост-4-ен-3,17-дион (АД) фирмы "Sigma" (США); 17а-ацетат кортексолона, 21-ацетат кортексолона и 17а,21-ди-ацетат кортексолона были предоставлены ВНИХ-ФИ (Россия). Андрост-1,4-диен-3,17-дион (АДД) (чистота — 97%) и андрост-4-ен-9а-ол-3,17-дион (9-ОН-АД) (чистота — 98%) были получены в лаборатории микробиологической трансформации органических соединений (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, Россия). Кетоконазол, N-метил-
N-Hmpo-N-нитрозогуанидин (НГ), комплекс ли-тических ферментов из Trichoderma harzianum фирмы "Sigma" (США), дрожжевой экстракт фирмы "Дифко" (США). Остальные реактивы были получены от российских производителей.
Микроорганизм. Штамм Curvularia lunata ВКМ F-644 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН).
Культивирование штамма. Культуру C. lunata выращивали в 100 мл среды следующего состава (г/л дистиллированной воды): сахароза—30.0, дрожжевой экстракт—2.5, NaN03-2.0, (NH4)2HP04-3.0, KCl—0.5, MgS04—0.5, FeS04—0.01, KH2P04-27.2, K2HP04—9.0, рН 6.0—6.2, на качалке при 220 об/мин и 29°С в течение 48 ч. Посевной материал (10 об. %) переносили в свежую среду того же состава и продолжали инкубацию в течение 48 ч. Полученный мицелий отмывали K-фосфатным буфером (рН 6.0) и использовали для последующих экспериментов.
Получение протопластов. Мицелий отделяли фильтрованием, промывали дистиллированной водой и центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Суспендировали 100 мг сырого мицелия в 1 мл лизирующей смеси, содержащей 2—30 мг комплекса литических ферментов, 0.6—1.0 М осмоста-билизатора (KCl, NH4Cl или MgS04) и 0.1 М K-фос-фатного буфера (рН 6.0). Инкубацию проводили на качалке (220 об/мин) при 29°С. Наличие протопластов контролировали через 1, 3, 5, 10 и 20 ч с помощью светового микроскопа. Подсчет числа протопластов проводили в камере Горяева. Протопласты отделяли от остатков неразрушенного мицелия и обломков клеток фильтрованием через стеклянный фильтр Шотта № 1 с последующим центрифугированием при 45000 g в течение 15 мин. Полученный осадок отделяли от супернатанта, дважды промывали 0.1 М К-фосфатным буфером (рН 6.0) с добавками 0.6—1.0 М осмостабилизатора (KCl, NH4Cl или MgS04) и ресуспендировали в 0.8 мл буфера того же состава.
Мутагенез протопластов. Суспензию протопластов инкубировали с НГ (25—300 мкг/мл) в течение 20 мин при 29°С, после чего осаждали центрифугированием при 45000 g, осадок промывали 0.1 М K-фосфатным буфером с 1 М NH4Cl и ресуспендировали в 0.8 мл буфера того же состава. Полученную суспензию высевали на агаризованную ростовую среду, содержащую 0.7—1.0 М осмостабилизатора (KCl, NH4Cl, MgS04 или сахарозы) и кетоконазол (0.1—1.5 мкмоль/л).
Световая и электронная микроскопия. Приготовление препаратов и микроскопирование осуществляли, как описано ранее [15].
Трансформация стероидов отмытым мицелием.
Конверсию стероидных субстратов проводили отмытым мицелием (10 г/л сухой биомассы) в 750 мл колбах Эрленмейера в 100 мл 0.1 М K-фосфатном
буфере (рН 6.0—6.2) при 220 об/мин и 29°С и в ферментере АНКУМ 2М (рабочий объем 1.5 л) при 400 об/мин, рО2 - 20-25% и 29°С. Стероидные субстраты (1-5 г/л) вносили в виде тонкоизмельчен-ных порошков или растворов в органических растворителях (конечная концентрация растворителей не превышала 4 об. %).
Анализ продуктов трансформации. Использовали методы ТСХ, колоночной хроматографии, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и 1H ЯМР-спектроскопии, как описано ранее [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Трансформация АД, АДД и 9-ОН-АД. Результаты анализа и идентификации метаболитов, полученных при инкубации мицелия C. lunata со стероидами ряда андростана, приведены на рис. 1. Продукты трансформации АД, АДД и 9-ОН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.