ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2012, том 62, № 1, с. 100-107
= МЕТОДИКА =
УДК 612.821.6
БИОЛИСТИЧЕСКАЯ ДОСТАВКА ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КРАСИТЕЛЕЙ В КЛЕТКИ СРЕЗОВ МОЗГА КРЫСЫ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ РЕГИСТРАЦИИ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ
© 2012 г. Н. А. Асеев, Е. С. Никитин, М. В. Рощин, В. Н. Иерусалимский, П. М. Балабан
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва,
e-mail: aseyev@ihna.ru Поступила в редакцию 21.03.2011 г.
Принята в печать 10.10.2011 г.
Для регистрации электрической активности нейронов оптическими методами в качестве зондов часто используют мономолекулярные потенциал-зависимые красители. Существующие на сегодняшний день способы доставки потенциал-зависимых красителей в нервную ткань имеют серьезные ограничения, сильно сужающие область их применения (нерастворимость в воде, ядовитость органических растворителей и самих потенциал-зависимых красителей в высоких концентрациях для живой ткани). Мы разработали новый метод доставки потенциал-зависимых красителей путем "выстреливания" микрочастиц золота, покрытых красителем, в переживающие срезы мозга. Трехмерная реконструкция флуоресцентного свечения нервной ткани на сканирующем конфокальном микроскопе показала, что при таком способе доставки краситель распространяется по клеточной мембране, полностью окрашивая только одну клетку-мишень с отростками и не распространяясь на окружающие клетки по межклеточной жидкости или через клеточные контакты. Разработанный метод окрашивания нейронов может быть применен для оптической регистрации электрической активности отдельных нейронов и анализа распространения электрического потенциала по компартментам возбудимых клеток (аксонам и дендритам).
Ключевые слова: биолистическая доставка, потенциал-зависимые красители, оптическая реги-страциия, нейрон, переживающие срезы мозга.
Fast and Aimed Delivery of Voltage-Sensitive Dyes to Mammalian Brain Slices by Biolistic Techniques
N. A. Aseyev, E. S. Nikitin, M. V. Roshchin, V. N. Ierusalimsky, P. M. Balaban
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, Moscow,
e-mail: aseyev@ihna.ru
Fast voltage-sensitive dyes (VSD) are widely used in modern neuroscience for optical recording of electrical potentials at many levels, from single cell compartment to brain areas, containing populations of many neural cells. The more lipophilic a VSD, the better signal-to-noise ratio of the optical signal, but there are no effective ways to deliver a water-insoluble dye into the membrane of live cell. Here we report a new protocol based on rapid biolistic delivery of VSDs, which is optimal for further recordings of optical signals from live neurons of rat brain slices. This protocol allows us to stain locally (150 mkm) neural somata of brain structures with a Golgi-like pattern, and a VSD propagates even to distant neurites of stained cells very quickly. This technique also can be used for rapid local delivery of any lipophilic and water-insoluble substances into live cells, further optical recording of neural activity, and analysis of potential propagation in a nerve cell.
Keywords: biolistic delivery, voltage-sensitive dyes, optical recording, neuron, live brain slices.
В современных нейробиологических исследованиях для регистрации и стимуляции активности мозга применяются оптические методы. В клеточной нейрофизиологии активно используются флуоресцентные вещества-сенсоры, которые изменяют спектр флуоресценции при контакте с исследуемыми молекулами. Среди них флуоресцентные ионоселективные сенсоры ионов металлов: натрия, магния, калия, кальция, цинка, а также хлорида, протонов (pH) и других ионов, низко- и высокомолекулярных сигнальных молекул [2, 4, 5, 8, 12, 18, 20]. Применение флуоресцентных сенсоров позволяет проводить прямой мониторинг и локализовать концентрации исследуемых веществ на культуре in situ с высоким временным и пространственным разрешением с использованием эпилюминесцентных и конфокальных сканирующих микроскопов. Особняком стоят флуоресцентные сенсоры, встраивающиеся в мембрану и реагирующие на изменения трансмембранного потенциала [10, 11]. В основе работы этих сенсоров лежат несколько разных механизмов изменения оптических свойств [13, 24]: поворот диполей внутри молекулы, димеризация молекул, эффект резонансного переноса энергии флуоресценции (РПЭФ, FRET — Förster Resonance Energy Transfer) и эффект электрохромизма. Наибольшее распространение получили сенсоры аминопиридинового ряда, их общепринятое название — быстрые потенциал-зависимые красители (ПЗК), которое подчеркивает их отличие от сенсоров, работающих по другим механизмам. Быстрые ПЗК аминопиридино-вого ряда представляют собой амфифильные молекулы, встраивающиеся в плазматическую мембрану и меняющие свою ориентацию (или ориентацию части молекулы) под воздействием электрического поля высокой напряженности. Эти структурные изменения молекул вызывают изменение их оптических свойств, а именно, сдвиг спектра флуоресценции в более длинноволновую область — эффект электрохромизма [22, 23]. В основном быстрые потенциал-зависимые красители показывают достаточно небольшие изменения флуоресценции при изменении потенциала на мембране (10-4—10-2 на 100 мВ). Тем не менее эти красители имеют очень короткое время отклика, обычно в микросекундном диапазоне, и смещение спектра линейно пропорционально изменению напряженности электрического поля [16], что делает быстрые
ПЗК весьма привлекательными для регистрации электрической активности в нервной ткани.
Потенциал-зависимые красители широко используются в нейробиологии для мониторинга быстрой и медленной электрической активности мозга на различных уровнях его организации [3]. Так, ПЗК с успехом используются для оптической регистрации суммарного ответа или фокальных потенциалов от больших нейронных популяций [15, 30]. В более детализованных экспериментальных подходах оптически записывают потенциалы действия и синаптические потенциалы определенного числа отдельных нейронов одновременно, что дает уникальную возможность исследователям раскрывать клеточные механизмы поведения животных [6], недоступные для регистрации другими методами. Однако клеточным уровнем возможности ПЗК не ограничиваются: они с успехом применяются в экспериментах на субклеточном уровне для регистрации распространения электрических потенциалов по мембране сомы и отростков нейронов [28]. Использование ПЗК на культурах нервной ткани, переживающих срезах, а с появлением в арсенале ученых двухфотон-ных микроскопов — и на целом мозге, позволяет регистрировать активность в нейритах: в дендритах, аксонах, в аксонном холмике, в стволе дендритного дерева, в шипиках, бифуркациях [24, 28]. Также есть работы, демонстрирующие применимость ПЗК для регистрации с молекулярным разрешением конформационных изменений в мембранных белках [30]. Резюмируя, можно сказать, что потенциал-зависимые красители очень широко используются для оптической регистрации электрофизиологических процессов.
Однако несмотря на использование ПЗК практически в любой области нейробиоло-гии, при работе с ними есть ряд проблем, требующих разрешения. Одна из главных проблем, связанных с применением потенциал-зависимых красителей, — это способ их доставки в клетку, так как аминопиридины по своей природе плохо растворимы в воде. В настоящее время существуют и широко применяются следующие техники доставки ПЗК [7]: 1) аппликация в раствор в виде суспензии и пассивная диффузия частичек красителя в мембрану; 2) ретроградное окрашивание по нерву; 3) микроинъекция в клетку. Кроме этих основных способов доставки недавно появились пока экзотические трансгенные
белковые ПЗК [4, 26], в которых сенсором является потенциал-зависимый ионный канал, а изменения в флуоресценции происходят за счет эффекта резонансного переноса энергии флуоресценции (РПЭФ, FRET). Эти ПЗК производятся белоксинтезирующим аппаратом клетки, и соответственно в доставке нуждается не сам краситель, а генетический материал (прямая трансфекция в клетку или производство трансгенной линии животных). Пока методика их применения очень сложна и находится в состоянии разработки, кроме того, по своим динамическим свойствам белковые ПЗК сильно уступают классическим низкомолекулярным ПЗК.
Одним из сравнительно новых методов доставки веществ в клетки является направление, представленное биолистикой (термин, полученный от синтеза слов "биология" и "баллистика", предложен первооткрывателями [9, 17]). Метод основан на придании частицам вещества высокой кинетической скорости в специальном пневматическом устройстве (биолистическая установка, gene gun, генная пушка или генный пистолет) для пробивания мембраны (которая мгновенно затягивается после момента "выстрела"). Для увеличения инерции частицы вещества обычно наносятся на более массивные сферические микрочастицы, изготовленные из тяжелых металлов (золото, вольфрам, платина), а для уменьшения сопротивления среды для разгона микрочастиц вместо воздуха используется низкий вакуум или гелий. В России разработкой вариантов метода биолисти-ческой доставки занимались в лаборатории И.А. Зеленина (Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта, Москва). Усилиями сотрудников этой лаборатории были разработаны протоколы трансфекции клеток в культуре и клеток мышечной ткани in vivo [1, 19]. Биолистическая установка работала по принципу огнестрельного оружия: взрыв пороха порождал образование и расширение газовой смеси, которая разгоняла в стволе вольфрамовые микропроектили. Одной из наиболее известных конструкций (в основном благодаря ее коммерческой доступности) является установка фирмы "Bio-Rad" (USA), распространяемая под торговым названием "Helios GeneGun".
В целом конструкции, разработанные и широко применяемые в настоящее время в разных областях биологических наук, не рассчитаны на работу с клетками мозга, так как
сильно повреждают нервную ткань. В некоторых случаях этого удается избежать (доставка нейротрейсеров в клетки зафиксированной ткани или плотные ганглионарные
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.