МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 5, с. 534-542
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282:632.4:632.937
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ ФИЛЛОСФЕРЫ СОРНЫХ И ДИКОРАСТУЩИХ ТРАВЯНИСТЫХ РАСТЕНИЙ
© 2014 г. А. О. Берестецкий1, Е. Л. Гасич, Е. В. Полуэктова, Е. В. Николаева, С. В. Сокорнова, Л. Б. Хлопунова
ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург Поступила в редакцию 09.01.2014 г.
Оценена антимикробная, фитотоксическая и инсектицидная активность 30 изолятов фитопатоген-ных и эндофитных грибов, выделенных из надземных органов сорных и дикорастущих травянистых растений. Таксономически они представляли собой анаморфные формы аскомицетов, преимущественно из группы пикнидальных целомицетов. Результаты оценки их антимикробной активности методами агаровых блоков и бумажных дисков показали, что более 50% изученных грибов проявило антибактериальную активность в отношении Bacillus subtilis и/или Pseudomonas syringae pv. lachry-mans, 40% — антифунгальную против Candida tropicalis. Экстракты 47% изолятов микромицетов были фитотоксичны в отношении изолированных листьев Arabidopsis thaliana и/или Elytrigia repens. У 40% изолятов выявили инсектицидную активность против личинок виковой тли. Таким образом, грибы филлосферы сорных и дикорастущих травянистых растений могут обладать широким спектром биологической активности. Предполагается, что это их свойство может иметь практическое значение для токсикологической оценки патогенов сорных растений, являющимися потенциальными микогербицидами. Полученные результаты говорят о том, что микромицеты могут играть важную регулирующую роль в формировании биоценозов филлосферы.
Ключевые слова: антимикробная активность, фитотоксичность, афицидная активность, грибы, фил-лосфера.
DOI: 10.7868/S002636561405005X
Грибы филлосферы, в частности эндофитные микромицеты, к которым иногда относят слабопатогенные и сапротрофные виды из родов Altermaria, Colletotrichum, Phoma, Phomopsis, в последнее время привлекают внимание исследователей как потенциальные продуценты биологически активных веществ (БАВ). Описанию структуры и свойств БАВ, образуемых эндофитами, растениями-хозяевами которых, как правило, были либо лекарственные растения, либо деревья тропических лесов, посвящен ряд сравнительно свежих обзоров [1—4]. Недостаточно изученными являются грибы филлосферы сорных и дикорастущих травянистых растений.
Для скрининга новых продуцентов БАВ нами были отобраны 30 изолятов анаморфных аскомицетов (фитопатогены и эндофиты), выделенных из надземных органов сорных и дикорастущих растений. Выбор данной группы грибов был направлен на решение нескольких задач: 1) поиск продуцентов гербицидных, антимикробных и инсектицидных метаболитов, 2) определение возможного уровня безопасности потенциальных
1 Автор для корреспонденции (e-mail: aberestetski@yahoo.com).
микогербицидов для окружающей среды, 3) изучение потенциала вторичных метаболитов грибов в формировании биоценозов филлосферы травянистых растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы 30 изолятов грибов из рабочей коллекции чистых культур лаборатории микологии и фитопатологии Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ВИЗР). Среди них было 9 эндофитов и 21 фитопатоген. Культуры хранились при 5°С на стандартном картофельно-глюкозном агаре (КГА). Для получения посевного материала штаммы грибов выращивали 2 недели на КГА при температуре 24°С. Список использованных грибов приведен в таблице.
Для выявления антимикробных свойств грибов использовали следующие микроорганизмы: Pseudomonas syringae pv. lachrymans штамм 11 (ВНИИФ), грамположительные бактерии Bacillus subtilis штамм ВНИИСХМ 78 и Candida tropicalis. Их культивирование проводили на КГА при 30°С.
Список изолятов грибов, использованных в работе
Вид гриба Изолят Экологическая группа Растение-хозяин Географическое происхождение
Acremonium sp. 16.5 Эндофит Convolvulus arvensis Санкт-Петербург
Epicoccum nigrum 5.14 Эндофит Cirsium arvense Ленинградская обл.
Vermicularia sp. 13.20 Эндофит Heracleum sosnowskyi Ленинградская обл.
Botrytis cinerea 47.1 Фитопатоген Galinsoga parviflora Украина, Сумская обл.
Sclerotinia sclerotiorum Scl Фитопатоген Cannabis sativa Пензенская обл.
Ascochyta chenopodiicola 17.28 Фитопатоген Chenopodium album Пензенская обл.
Bipolaris sorokiniana 39.3 Фитопатоген Atriplex sp. Пензенская обл.
Chaetopyrena sp. 52.2 Эндофит Chenopodium album Китай, Харбин
52.5 Эндофит Convolvulus arvensis Краснодарский край
Colletotrichum gloeosporioides 13.3 Фитопатоген Galinsoga parviflora Украина, Сумская обл.
Coniothyrium sp. 53.6 Эндофит Chenopodium album Китай, Харбин
Passalora dubia 38.23 Фитопатоген Ch. album Самарская обл.
Phoma sp. 9.247 Фитопатоген Artemisia vulgaris Владивосток
17.19 Фитопатоген Convolvulus arvensis Кыргызстан, Чуйская обл.
32.49 Фитопатоген Chenopodium sp. Пензенская обл.
32.97 Фитопатоген Arctium tomentosum Хабаровский край
32.136 Фитопатоген Arctium sp. Иркутск
22.2 Фитопатоген Chenopodium urbicum Орловская обл.
22.5 Фитопатоген Ch. urbicum Краснодар
32.137 Фитопатоген Chenopodium sp. Иркутск
17.18 Фитопатоген Ch. album Ленинградская обл.
17.52 Фитопатоген Ch. album Липецкая обл.
Septoria atriplicis 9.105 Фитопатоген Ch. album Китай, Харбин
S. calystegiae 9.301 Фитопатоген Calystegia sepium С.-Петербург
9.302 Фитопатоген Convolvulus arvensis Дагестан, Дербент
Stagonospora convolvuli 9.296 Фитопатоген C. arvensis С.-Петербург
Phomopsis asteriscus 61.4 Фитопатоген Heracleum sibiricum Ленинградская обл.
Ph. albicans 32.22 Эндофит Lepidotheca suaveolens Карелия, о-в Валаам
Ph. malvacearum 61.2 Эндофит Abutilon theophrastii Приморский край
Ph. morphaea 3.1 Эндофит Papaver rhoeas Ставропольский край
Для первичного скрининга продуцентов антибиотических веществ методом агаровых блоков грибы культивировали на трех агаризованных (1.5% агар-агара) питательных средах: КГА, среде Чапека с витаминами (ЧА) и среде ДПГ (на основе дрожжевого экстракта, пептона и глюкозы). Грибы инкубировали при температуре 24° С в течение 3 недель.
Для жидкофазного поверхностного культивирования грибов использовали жидкую среду ДПГ.
Фитотоксическую активность экстрактов испытывали на отсеченных листьях Arabidopsis thaliana и 4-см отрезках листьев пырея ползучего (Elytrigia repens). Растения выращивали в горшках со стандартной почвенной смесью при температуре 24° С днем и 20° С ночью при переменном искусственном освещении (16 ч в день). Отсеченные листья инкубировали во влажной камере — пластиковых прозрачных контейнерах, выстланных увлажненной фильтровальной бумагой.
БЕРЕСТЕЦКИИ и др. (а)
32.22 32.49 Scl
17.52 5.14
Изолят (б)
22.5
17.28
9.302 32.22 9.296
32.49
17.52
17.28 22.5
ЧА
КГА
ДПГ
ЧА
КГА
ДПГ
Изолят
Рис. 1. Антибактериальная активность грибов филлосферы в отношении (а) — Bacillus subtilis; (б) — Pseudomonas syrin-gae. Показаны результаты, достоверно отличающиеся от контроля при Р = 0.95.
Среду (100 мл в 500-мл конических колбах) стерилизовали 30 мин при 109°С и инокулировали блоком (5 мм в диаметре), вырезанным из края посевной культуры. Культуры грибов инкубировали без встряхивания 14 сут при постоянной температуре 24° С.
Для получения экстрактов культуральную жидкость (100 мл) отделяли от мицелия фильтрованием и экстрагировали тремя порциями хлористого метилена (50, 100 и 150 мл). Порции экстрактов объединяли и обезвоживали фильтрованием через безводный сернокислый натрий. После выпаривания растворителя определяли массу сухого остатка и проводили оценку его биологической активности.
Для оценки антибиотической активности использовали стандартные методы агаровых блоков и бумажных дисков (концентрация 100 мкг/диск) [5]. Для определения фитотоксичности экстрактов (концентрация 5 мг/мл) использовали метод листовых дисков [6]. Контактную инсектицидную активность экстрактов (концентрация 0.4%) оценивали на личинках виковой тли [7].
Опыты проведены как минимум в 3 повторно-стях. Средние значения сравнивали при помощи критерия наименьшей существенной разницы (НСР) при уровне вероятности 95%. Расчеты проведены при помощи программы Statistica 6.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка антимикробной активности методом агаровых блоков. Наблюдали существенные различия в антимикробной активности 30 изолятов грибов, выявленной методом агаровых блоков в отношении трех микроорганизмов. Антибактериальную активность проявило девять изолятов (30%) изученных микромицетов. Однако для двух изученных видов бактерий были активными только семь (23%) изолятов грибов. В целом, максимальную антибактериальную активность проявили изоляты Ascochyta chenopodiicola 17.28 и Phoma sp. 22.5 (рис. 1). Эти же изоляты наряду с Epicoccum nigrum 5.14 сильно ингибировали рост Candida tropicalis (рис. 2).
Состав агаризованной питательной среды существенно влиял на антибиотическую актив-
32.22 9.296 9.з02
17.52
32.49
17.28
22.5
Изолят
5.14
ЧА
КГА
ДПГ
Рис. 2. Антифунгальная активность грибов филлосферы в отношении Candida tropicalis. Показаны результаты, достоверно отличающиеся от контроля при Р = 0.95.
ность грибов. Продуценты антибактериальных метаболитов выявлялись лучше всего на среде ДПГ, в то время как антигрибных — на КГА. Отмечено существенное взаимодействие изученных факторов — "состав агаризованной питательной среды" и "изолят гриба". Так, наиболее сильно ингибировали рост обоих видов тест-бактерий культуры A. chenopodiicola 17.28 и Phoma sp. 17.52, полученные на ДПГ. Для проявления антибактериальной активности для Phoma sp. 22.5 были оптимальны среда Чапека и КГА (рис. 1а). Epicoccum nigrum 5.14 проявил активность в отношении Bacillus subtilis при культивировании на всех трех использованных средах; в отношении Pseudomonas syringae были активны культуры гриба, полученные лишь на КГА (рис. 1). Sclerotinia sclerotiorum был активен против B. subtilis при культивировании на КГА и ДПГ, в то время как бактерия P. sy-ringae была вообще нечувствительна к экзомета-болитам этого гриба. Phoma sp. 32.49 ингибировал рост обоих видов ба
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.