ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 1, с. 85-94
УДК 582.272:57.083.13:576.315
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПИДОВ И ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ ПИГМЕНТОВ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ Sargassum pallidum (Turner) C. Agardh © 2014 г. Н. И. Герасименко, Е. А. Мартыяс, С. В. Логвинов, Н. Г. Бусарова
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН,
Владивосток, 690022, e-mail: gerana@piboc.dvo.ru Поступила в редакцию 17.04.2013 г.
Исследована биологическая активность липидов и фотосинтетических пигментов бурой водоросли Sargassum pallidum (Turner) C. Agardh. Свободные жирные кислоты и их эфиры проявляли заметную антимикробную активность в отношении бактерий (Staphylococcus aureus, Escherichia coli), дрожже-подобных грибов (Candida albicans), условно-патогенных (Aspergilius niger) и фитопатогенных (Fusa-rium oxysporum, Septoria glycines) грибов, умеренную активность проявляли глицерогликолипиды и нейтральные липиды. Фукоксантин и хлорофиллы слабо подавляли рост микроорганизмов. Все исследованные вещества были не активны в отношении карциномы Эрлиха. Показано, что сезон сбора водоросли оказывал заметное влияние на антимикробную и гемолитическую активности разных классов липидов, что связано с изменениями в составе жирных кислот липидов.
DOI: 10.7868/S0555109914010036
Бактерии являются причиной многих болезней, для лечения которых используются антибиотики. Однако широкое и беспорядочное применение антибиотиков привело в результате к возникновению у микроорганизмов устойчивости к антибиотикам, что понизило их эффективность. Огромное число исследователей в мире занято проблемой поиска природных веществ с антимикробными и противовирусными свойствами среди морских организмов, в частности среди разных отделов водорослей [1—17]. Большое внимание авторы в своих исследованиях уделяют жирным кислотам, определяя некоторые из них как антибиотические вещества. Так было показано, что гексадекатетраеновая (16:4 n-3), октадека-тетраеновая (18:4 n-3, стеаридоновая), гексатрие-новая (16:3 n-3) кислоты ответственны за антибиотическую активность. Они ингибируют рост Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Proteus vulgaris [18]. 9-гептадеценовая (17:1) кислота и ее метиловый эфир также проявляли антибиотическую ак-
Cокращения: ГЛ — глицерогликолипиды, ДАГ — диацилгли-церины, ДГДГ — дигалактозилдиацилглицерины, ЖК — жирные кислоты, МГДГ — моногалактозилдиацилглицери-ны, МЭЖК — метиловые эфиры ЖК, НЖК — насыщенные ЖК, НЛ — нейтральные липиды, ННЖК — ненасыщенные ЖК, СЖК — свободные ЖК, СЛ — суммарные липиды, СС — свободные стерины, СХДГ — сульфохиновозилдиацилгли-церины, ТАГ — триацилглицерины, ФСП — фотосинтетические пигменты.
тивность [19]. Охта с соавт. [20] исследовали антибиотическую активность 10 жирных кислот и их метиловых эфиров и нашли, что гамма-линоленовая (18:3 n-6) имела наивысшую антибиотическую активность против метициллин-резистентного штамма S. aureus, а альфа-линоленовая (18:3 n-3), эйкоза-пентаеновая (20:5 n-3) и докозагексаеновая (22:6 n-3) кислоты показали значительную антибиотическую активность. Такие жирные кислоты, как олеиновая (18:1 n-9), линолевая (18:2 n-6), лаури-новая (12:0) и миристиновая (14:0) являются анти-микобактериальными веществами. Олеиновая кислота среди них наиболее сильно ингибирует рост Mycobacterium smegmatis [8].
На присутствие противомикробных веществ исследованы в основном водоросли, растущие в теплых водах. Это тропические водоросли Атлантики [2] и Индо-Пацифики [4], водоросли с побережья Юкатана (Мексика) [3, 21, 22], Черного моря [10], южной Африки [5, 9], с атлантического и средиземноморского побережья Марокко [23], Нормандии [24], Мраморного моря (Турция) [25], Бразилии [26]. Большая часть экстрактов водорослей ингибировала рост различных патогенов, грибов и паразитов. Более выраженный ингиби-рующий эффект проявлялся в отношении одного или нескольких микроорганизмов. Среди перспективных водорослей, экстракты которых активно подавляли рост широкого спектра микро-
организмов, в литературе названы бурые водоросли рода Sargassum, Lobophora variegate, Dictyota humifusa, красные водоросли рода Laurencia, Por-tiera hornemanii, Mastocarpus stellatus, Dasyapedicel-lata, зеленые водоросли: Halimeda copiosa, Penicil-lus capitatus, Bryopsispennata, Codium bursa, Cauler-pa racemosa.
В большинстве публикаций представлены результаты исследования биологической активности экстрактов водорослей, химический состав которых не был охарактеризован. Авторы не соотносили проявление биологической активности с конкретными веществами или их смесями. В последние годы стали интенсивно изучаться биологические активности отдельных компонентов экстрактов водорослей, например активности по-лифенольных соединений (флоротанинов) [27], пластохинонов, [28, 29], фукоксантина [30—32], жирных кислот [6, 7, 12] и глицерогликолипидов [1, 16, 33, 34].
Показано, что противомикробная активность веществ зависит от репродуктивного статуса и сезона сбора водоросли [23, 35]. Так, экстракты из зеленой водоросли Enteromorpha compressa, бурых водорослей Sacchoriza polyschides, Cystoseira mediterranea, C. usneoides с французского побережья Средиземного моря, собранных зимой, были не активны против S. aureus, а экстракты из летних образцов этих водорослей активно ингибировали рост бактерии [35]. Высокую активность против S. aureus проявили метанольные экстракты из фертильных водорослей Ulva lactuca, собранных в августе, но не обнаружили активности у экстрактов из вегетирующих водорослей, собранных зимой [23]. По мнению авторов, водоросли с побережья Марокко, являются потенциальным источником биоактивных веществ и могут быть исследованы как природные антибиотики, для чего необходимо определение природы и структуры этих веществ [23].
Цель работы — исследование противомикроб-ной, цитотоксической и гемолитической активности суммарных липидов, отдельных фракций и классов липидов, ФСП из бурой водоросли Sargassum pallidum (Японское море), а также влияния сезона сбора водоросли на степень активности этих веществ и участие ЖК в проявлении сезонной активности.
МЕТОДИКА
Водоросли Sargassum pallidum (Turner) C. Agardh (Phaeophyceae, род Sargassum) были собраны в период с марта по ноябрь в бухте Троицы залива Петра Великого Японского моря на морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН.
Каждая выборка водорослей содержала 3—5 талломов.
Из измельченных на мясорубке водорослей отбирали 0.2 кг тканей и экстрагировали СЛ последовательно этиловым спиртом (0.3 л), смесями этилового спирта с ацетоном (1 : 1 об./об., 0.3 л) и с хлороформом (1 : 1 об./об., 0.3 л), используя гомогенизатор. Экстракты объединяли, добавляли хлороформ (0.5 л) и воду (0.5 л). После разделения смеси на две фазы, отбирали нижнюю фазу, содержащую липиды и ФСП (липофильный экстракт), упаривали досуха на вакуумном роторном испарителе. Сухой остаток (после взвешивания) растворяли в гексане и использовали для разделения веществ на колонке с силикагелем. Верхнюю фазу упаривали до объема 50—100 мл (гидрофильный экстракт) и использовали для исследования противомикробной активности.
Колонку I (18 х 2.5 см) заполняли 40 г силика-геля 40—100 мкм ("Chemapol", Чехия) в гексане. На поверхность сорбента наносили 500 мг суммарных липидов в 50 мл гексана. Для элюирова-ния нейтральных липидов и ФСП использовали последовательно гексан (100 мл), смеси диэтило-вого эфира в гексане, с возрастающим содержанием эфира (от 95 : 5 до 50 : 50 (об./об.), по 100 мл каждая), хлороформ (200 мл). Собирали фракции объемом 20 мл. Процесс элюирования контролировали с помощью ТСХ на пластинах (6 х 6 см) с силикагелем (Silica gel 60F254, "Merck", Германия), используя систему растворителей гексан—диэтиловый эфир—уксусная кислота 80 : 20 : 1 (об./об./об.) и стандарты ТАГ, СЖК, холестерин, фукоксантин, хлорофилл. Отбирали фракции, содержащие ЭЖК, ТАГ, СЖК, СС, хлорофилл a, ДАГ, фукок-сантин (приведены в порядке выхода с колонки), которые очищали от примесей дополнительно на колонках (6—7 х 1 см) с силикагелем (4—5 г) 20—40 мкм. После элюирования с колон-ки-I перечисленных веществ, проводили элюи-рование полярных компонентов, применяя смеси этилового спирта и хлороформа, с возрастающим содержанием этилового спирта (от 95 : 5 до 70 : 30, об./об.). Фракции собирали по 25 мл. Выход веществ с колонки контролировали ТСХ в системе ацетон—бензол—Н2О 91 : 30 : 8 (об./об./об.) в присутствии стандартов ГЛ из шпината Spinacia oleracea. Фракции, содержащие МГДГ (в августовском экстракте дополнительно моногалактозил-моноацилглицерины — МГМГ), ДГДГ, СХДГ дополнительно очищали на колонках (6—7 х 1 см) с силикагелем (4—5 г) 20—40 мкм, используя хлороформ-ацетоновые смеси (от 95 : 5 до 70 : 30, об./об.) для получения этих веществ в хромато-графически чистом виде.
Таблица 1. Антимикробная активность веществ из Sargassumpallidum*
Вещество Время сбора, Зона лизиса, мм
месяц S. aureus E. coli C. albicans A. niger F. oxysporum S. glycines
МГДГ март 2.5 ± 0.2 - 3.0 ± 0.0 4.0 ± 0.0 - -
июнь - 2.0 ± 0.0 - - - 4.0 ± 0.0
август - - - - - 2.0 ± 0.
ноябрь 3.0 ± 0.0 2.2 ± 0.2 1.2 ± 0.3 - 1.0 ± 0.0 -
МГМГ август 4.0 ± 0.0 - - - 4.0 ± 0.0 -
ДГДГ август - - 4.5 ± 0.2 - 2.0 ± 0.0 -
ноябрь - - 2.7 ± 0.2 - - -
СХДГ март 1.5 ± 0.0 1.0 ± 0.0 - 2.0 ± 0.0 - 5.7 ± 0.2
август - - 1.0 ± 0.0 - 1.7 ± 0.3 -
ноябрь - - - - U ±0.2 -
СЖК март 2.0 ± 0.0 2.0 ± 0.0 - - - -
СЖК1 август - - - 3.0 ± 0.0 - -
СЖК2 август 14.5 ± 0.2 - 3.0 ± 0.0 5.7 ± 0.3 - 2.8 ± 0.2
ЭЖК март - - 2.0 ± 0.0 3.0 ± 0.0 - -
ЭЖК август - - - - 2.0 ± 0.0 -
ЭЖК ноябрь 6.8 ± 0.2 6.7 ± 0.2 2.7 ± 0.3 3.7 ± 0.2 5.2 ± 0.2 -
ТАГ-СС март - - - 5.0 ± 0.0 1.7 ± 0.2 -
Хл-СС июнь - 2.0 ± 0.0 - - - -
СС ноябрь 0.7 ± 0.0 0.5 ± 0.0 2.7 ± 0.3 4.7 ± 0.3 3.7 ± 0.2 -
ДАГ август - - - - 1.5 ± 0.0 -
ДАГ ноябрь 2.5 ± 0.2 - - 4.0 ± 0.0 - -
* Знак "—" — отсутствие активности.
МЭЖК получали переэтерификацией липи-дов, по методу Превот и Мордрет [36]: к 5—7 мг СЛ в 2 мл гексана добавляли 0.4 мл 2.0 М КОН в метаноле, смесь перемешивали 10
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.