Ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 5, с. 606-611
УДК 577.19
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СЕВАНОЛА И ЕГО АНАЛОГОВ1
© 2015 г. Д. И. Осмаков, С. Г. Кошелев, О. А. Белозерова, В. С. Кублицкий, Я. А. Андреев*, Е. В. Гришин, С. А. Козлов
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 02.04.2015 г. Принята к печати 22.04.2015 г.
Ранее из чабреца Thymus armeniacus был выделен новый лигнан — севанол, установлена его структура и показано, что он эффективно ингибирует работу кислоточувствительного канала ASIC3, а также проявляет ярко выраженное анальгетическое и противовоспалительное действие. В рамках данной работы в электрофизиологических экспериментах на человеческих ASIC3 каналах, экспресси-рованных в ооцитах Xenopus laevis, была измерена биологическая активность аналога севанола, полученного химическим синтезом, его стереоизомера и соединения-предшественника, молекула которого представляет собой половину молекулы севанола. Измеренная ингибирующая активность синтетического аналога совпала с активностью природного образца, стереоизомер показал падение ингибирующей активности примерно на треть, а предшественник был еще менее эффективным ингибитором. Таким образом, была показана значимость функциональных групп и пространственной конфигурации севанола для его биологической активности, что важно учитывать при планировании оптимального метода его синтеза и разработке лекарственных препаратов на его основе.
Ключевые слова: анальгетик, ASIC3 канал, кислоточувствительные каналы, севанол, электрофизиологические исследования.
DOI: 10.7868/S0132342315050103
ВВЕДЕНИЕ
Кислоточувствительные ионные каналы или ASICs (от acid-sensing ion channels) относятся к надсемейству амилоридчувствительных дегене-рин/эпителиальных Ма+-каналов. Они были обнаружены в нейронах как периферической, так и центральной нервной системы (ЦНС) [1—5]. Мембранная топология каждой субъединицы канала, который функционирует в виде тримера, представляет собой внутриклеточные N- и C- концевые домены, два трансмембранных домена и большую внеклеточную петлю, которая составляет 2/3 от общей величины рецептора [6, 7]. Из шести известных на данный момент изоформ ASIC-каналов млекопитающих наибольшее распространение и физиологический вклад имеют две: ASIC^ и ASIC3. ASIC^ широко представлен в
1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г
Сокращения: ASIC — кислоточувствительный канал, BSA — бычий сывороточный альбумин, HEPES — 4-(2-гидрокси-этил)-1-пиперазинэтансульфокислота, IC50 — полуингибиру-ющая концентрация, TFA — трифторуксусная кислота, офВЭЖХ — обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография. # Автор для переписки (тел.: +7(495) 336-65-40, факс: +7 (495) 330-73-01, e-mail: ay@land.ru).
различных отделах ЦНС, играет важную роль в процессах синаптической пластичности, обучении и памяти, а также задействован в ишемиче-ских процессах и тревожных расстройствах [3, 8, 9]. ASIC3, распространенный в периферической нервной системе, участвует в восприятии кислотоопосредованной, воспалительной боли (как острой, так и хронической), а также боли от различных механических стимулов [4, 10, 11]. В связи с этим данные рецепторы считаются перспективными мишенями для действия анальгети-ческих и противовоспалительных лекарственных средств будущего.
Для создания фармацевтических препаратов актуально использование селективных лигандов ASICs, обладающих ингибирующим эффектом. Такие лиганды известны, они представлены разнообразными по химической природе молекулами — как веществами природного происхождения, так и синтезированными de novo [12]. Наиболее активными и селективными лигандами являются пептиды природного происхождения, такие как PcTx1 (модулятор ASIC1a) [13], APETx2, Hcr1b-1 и Ugr9-1 - ингибиторы ASIC3-канала [14-16]. Однако наиболее перспективным для медицинского применения считаются низкомолекулярные лиганды. Для изучения ASIC-каналов наиболее часто используется
амилорид (низкомолекулярный К+-задерживаю-щий диуретический агент), ингибирующий все функциональные изоформы ASICs (при концентрации IC50 10—60 мкМ) [1, 17]. Ингибирование ASIC-каналов было показано также для целого ряда низкомолекулярных соединений различных по природе. Так, A-317567 неселективно ингибирует токи ASIC-каналов (IC50 2—30 мкМ) [18]. Представители нестероидных противовоспалительных препаратов действуют на разные изоформы ASIC: так ибупрофен и флурбипрофен, например, ингибиру-ют ASIOa-содержащие каналы с IC50 3 50 мкМ, тогда как аспирин и диклофенак являются ингибиторами ASIC3-содержащих каналов (IC50 260 и 92 мкМ, соответственно) [19]. Среди соединений с ингибирующим действием следует также отметить: диариламидины (неспецифическое ингибирование нейрональных ASIC-токов с IC50 0.3—40 мкМ) [20], хлорогеновую кислоту и гастродин (компоненты растительного происхождения, ингибирующие ASIC-токи в сенсорных нейронах крысы) [21, 22]. Большинство из перечисленных низкомолекулярных соединений имеет клиническое применение, и все они демонстрировали в тестах in vivo противоболевой, противовоспалительный или нейропротек-торный эффекты [8, 18, 23].
К сожалению, специфичность действия низкомолекулярных лигандов низка. Поэтому особый интерес вызывает севанол (9,10-диизоцитри-ловый эфир эпифилловой кислоты), выделенный в лаборатории Нейрецепторов и нейрергуляторов ИБХ РАН из чабреца Thymus armeniacus, который эффективно ингибирует токи через канал ASIC3 и в 6 раз с меньшей эффективностью — через канал ASIC^ [24]. На моделях кислотоиндуциро-ванной боли и тепловой гиперчувствительности, вызванной воспалительным процессом, севанол демонстрировал ярко выраженный анальгетиче-ский эффект [24].
В данной работе представлено сравнение биологической активности синтетического аналога севанола, его стереоизомера и фрагмента, составляющего половину его молекулы. Данный структурно-функциональный анализ демонстрирует корреляцию величины ингибирующего эффекта, как от количества функциональных групп, так и от стереоизомерии молекулы, что может иметь важное значение для рационального дизайна биологически активных соединений на основе севанола.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки потенциала сырьевой базы для выделения природного севанола нами были взяты 4 разных вида чабреца: T. eubajcalensis (тимьян байкальский), T. serpyllum (тимьян ползучий), T. vulgaris (тимьян обыкновенный) и T. armeniacus (тимьян армянский). По данным масс-спектрометрического
анализа и сравнения хроматографических профилей экстрактов, было показано, что только в чабреце вида T. armeniacus присутствует севанол (данные не приведены). При этом выход севанола составил 1.4% от исходного растительного материала [24, данная работа], что является довольно высоким показателем для компонента, не характерного для данного рода, такого например, как тимол. Однако, привязанность к ареалу обитания и, возможно, к сезонным колебаниям делает затруднительным и нерентабельным выделение севанола непосредственно из природного сырья.
В связи с этим целесообразным явилось получение синтетического аналога, синтез которого был разработан в лаборатории биофармацевтики ИБХ РАН. Для того, чтобы доказать соответствие химического аналога природной молекуле, были использованы физико-химические и биологические методы. Полученный синтетический севанол совпадал с природным по массе (706.32 Да), по хро-матографической подвижности, по ЯМР-спектрам
25
и по удельному оптическому вращению ([а] 0 +65° ^ 1, НО)).
Для подтверждения биологической активно -сти синтетического севанола были проведены электрофизиологические эксперименты на ооци-тах Xenopus laevis, экспрессирующих канал АБ1С3 человека. Для тестирования, наряду с севанолом (2) (рис. 1), были выбраны также два других соединения, получаемые в результате химического синтеза: это стереоизомер севанола (3) и фрагмент, составляющий половину севанола (соединение (1). Для оценки биологической активности в качестве образца сравнения использовали севанол, полученный из природного сырья. Природный сева-нол и его синтетический аналог (2) демонстрировали одинаковую активность, при концентрации 0.2 мМ подавляя токи А81С3 канала на 90%, при снижении концентрации до 0.1 мМ — на 60%. Соединения (1) и (3) при тех же концентрациях демонстрировали заметно худшую ингибирующую активность по отношению к А81С3-каналу (рис. 2). Соединение (3) ингибировало ток А81С3-канала при 0.2 мМ на 70% (при 0.1 мМ - на 40%), что слабее примерно на треть активности севанола и его химического аналога. Таким образом, было показано, что изменение пространственного положения всего лишь в одном хиральном центре значительно сказывается на активности молекулы. Соединение (1) подавляло токи А81С3-канала при 0.2 мМ на 40% (при 0.1 мМ эффект был незначительным), что говорит о том, что молекула, представляющая собой эфир кофейной и изоли-монной кислот, тоже обладает ингибирующей активностью относительно А81С3-канала. Стоит также отметить, что ингибирующий эффект всех трех синтетических соединений был обратимым, то есть пропадал после их отмывки.
608
ОСМАКОВ и др.
О СООН
НО НО
О
О^СООН
НООС
(1)
СООН
НО НО
О у СООН О СООН
О^ ^чСООН
ОН СООН
(2) (Севанол)
О СООН
НО НО
О у СООН О СООН
О. Л\\СООН
НООС ОН СООН
(3)
Рис. 1. Структура молекул, использовавшихся для биологического тестирования (соединение (2) является аналогом севанола).
рН 5.5
рН 5.5
рН 5.5
Рис. 2. Измерение ингибирующей активности севанола и его производных в концентрации 0.2 мМ на Л81С3-каналах человека, экспрессированных в ооцитах лягушки X. ¡ае™. Приведены записи измеренных токов через мембрану клетки, вызванных изменением рН наружного раствора с 7.8 до значения 5.5 (время аппликации соответствующего соединения и активирующего буфера приведены над кривыми). Приведенные записи токов были сделаны на одном ооците, измеряемые клетки были фиксированы при потенциале —50 мВ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.