БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 5, с. 311-319
Обзор
УДК 577.112+577.122 БИОХИМИЯ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ АКТИНИЙ: СТРУКТУРА, ФУНКЦИЯ, ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ1
© 2013 г. В. М. Табакмахер, М. М. Монастырная*, Е. В. Лейченко, И. Н. Гладких, Е. А. Зелепуга, В. Е. Чаусова, Е. С. Ткачева, И. Г. Агафонова, Э. П. Козловская
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. ЕляковаДВО РАН,Владивосток 690022
*e-mail: rital950@mail.ru
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
Приведены результаты структурно-функциональных исследований нейротоксинов, актинопоринов и ингибиторов протеиназ, продуцируемых тропической актинией Heteractis crispa (= Radianthus macrodactylus) и актинией низкобореальных вод Oulactis orientalis. Новые данные вносят значительный вклад в понимание механизмов действия данных биологически активных полипептидов морских кишечнополостных и представляют интерес для решения практических задач, связанных с биотехнологической разработкой на их основе лекарственных препаратов.
Ключевые слова: актинии, нейротоксины, актинопорины, ингибиторы протеиназ, структура, функция.
Biologically active polypeptides of sea anemones: structure, function, prospects for application.
V. M. Tabakmakher, M. M. Monastyrnaya, E. V Leichenko, I. N. Gladkikh, E. A. Zelepuga, V E. Chausova, E. S. Tkacheva, I. G. Agafonova, E. P. Kozlovskaya (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy ofSciences, Vladivostok 690022)
This paper presents the results of the structure-functional study of neurotoxins, actinoporins, and proteinase inhibitors from the tropical sea anemone Heteractis crispa (= Radianthus macrodactylus) and the low boreal sea anemone Oulactis orientalis. The new data significantly contribute to the knowledge of the mechanisms of action of polypeptides from marine coelenterates and can be useful for solving practical problems of biotechnological development of medicines. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 5, pp. 311-319).
Keywords: sea anemones, neurotoxins, actinoporins, proteinase inhibitors, structure, function.
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ АКТИНИЙ
Традиционным объектом исследований, проводимых в лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН с 1989 г., являются морские кишечнополостные - актинии. Начатое еще в прошлом столетии систематическое изучение этих животных к настоящему времени охватывает несколько десятков видов, обитающих преимущественно в тропических регионах Мирового океана (Messerli, Greenberg, 2006; Turk, Kem, 2009). Причиной пристального внимания ученых к организмам данной таксономической группы являются продуцируемые ими яды. Эти яды представляют собой сложные смеси биологически активных соединений белковой природы, среди которых для исследователей наиболее интересны нейротоксины, пороформирующие токсины (актинопорины), а также ингибиторы протеиназ, уникальные по специфичности и эффективности действия молекулы, способные влиять на различные физиологические процессы в теле жертвы или хищника (Turk, Kem, 2009). Наличие специализированных жалящих органелл-нематоцистов, на-
ходящихся в щупальцах актиний и имеющих сложную анатомическую структуру, позволяет им охотиться или защищаться от хищников, впрыскивая ядовитый секрет в тело проплывающего мимо организма-мишени. Работая в синергизме, токсичные компоненты, входящие в состав яда, выполняют алломональную функцию и определяют экологическую нишу актиний в морском биоценозе.
Биологическая роль полипептидов актиний обусловлена способом их взаимодействия со своими мишенями: токсические эффекты нейротоксинов связаны с модификацией "воротного механизма" потенциал-чувствительных №+-каналов элекгровозбу-димых мембран; литическое действие актинопоринов определяется их способностью формировать поры в цитоплазматических мембранах; ингибиторы протеиназ защищают животное от переваривания протеиназами жертв, самопереваривания собственными протеолити-ческими ферментами, а также ингибируют расщепление протеиназами нейро- и цитотоксинов, в комплексе с которыми находятся в организме.
Благодаря применению комплексного подхода к изучению биологической активности полипепти-
1 Работа поддержана программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" № 12-1-П6-10 и грантом РФФИ № 11-04-01179-а.
дов, сочетающего традиционные физико-химические, биохимические и элекгрофизиологические методы с молекулярно-биологическими и биоинформатически-ми, нам удалось обнаружить в нескольких видах актиний новые полипептиды с новыми функциями: полифункциональные полипептиды, структурно гомологичные ингибиторам протеиназ Кунитц-типа, способные инги-бировать также болевой ваниллоидный TRPVl-рецептор (Andreev et al., 2008), и низкомолекулярные нейротокси-ны, блокирующие болевой кислоточувствительный Na+-канал ASIC3 (Козлов и др., 2012). Наличие таких фармакологических эффектов у полипептидов актиний, как кардиостимулирующий (Сорокина и др., 1984), антиопухолевый (Fedorov et al., 2010), анальгетический (Козлов и др., 2009), антигистаминный (Monastyrnaya et al., 2002; Сокотун и др., 2007) и др., побуждает проводить интенсивный поиск источников новых полипептидов, а также новых мишеней их действия.
К настоящему времени нами получено несколько индивидуальных полипептидов из тропической актинии Heteractis crispa и дальневосточной актинии Oulactis orientalis. Установлены аминокислотные последовательности пяти нативных нейротоксинов, трех акгинопори-нов и двух ингибиторов сериновых протеиназ. Методами молекулярной биологии показано, что акгинопорины и полипептиды Кунитц-типа из Н. crispa принадлежат к мультигенным семействам; получены новые данные о механизмах их функционирования.
Целью проводимых исследований являются поиск новых перспективных источников биологически активных полипептидов, изучение полиморфизма кодирующих их генов, установление структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов для дальнейшего конструирования новых лекарственных препаратов направленного действия на различные биологические мишени.
HETERACTISНЕЙРОТОКСИНЫ: ВЫДЕЛЕНИЕ,
СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И АКТИВНОСТЬ
Скрининг 35 видов актиний, собранных на литорали морей Тихого, Атлантического и Индийского океанов, показал, что наиболее перспективными для проведения структурно-функциональных исследований являются широко распространенная в Индийском океане тропическая актиния Н. crispa (ранее Radianthus macrodactylus) из семейства Stichodactylidae и актиния низкобореаль-ных вод О. orientalis (семейство Actiniidae). Из водно-этанольного экстракта Н. crispa методами гидрофобной хроматографии на полихроме-1, ионообменной хроматографии на Bio-Rex 70 и SP-Sephadex С-25, а также обращенно-фазовой ВЭЖХ на Silasorb С18 выделено в индивидуальном состоянии пять высокотоксичных полипептидов, названных нейротоксинами RTX-I, -II, -III, -IV и -V (Зыкова и др., 1985а, б, 1988; Зыкова, Козловская, 1989а, б). Значения летальных доз Heteractis токсинов для млекопитающих (мышь) варьировали от 3000 мкг/кг (RTX-I) до 40 и 25 мкг/кг (RTX-IV и RTX-III
соответственно), в то время как для крабов наблюдалась обратная закономерность. Было установлено, что все Heteractis нейротоксины обладают высокой термостабильностью и сохраняют активность при нагревании до 80°С и в широком диапазоне значений рН.
Методами структурной белковой химии установлены полные аминокислотные последовательности RTX-I -RTX-V (Зыкова и др., 1985а, б, 1988; Зыкова, Козловская, 1989а). Впервые было показано, что Heteractis нейротоксины принадлежат к новому структурному типу 2 так называемых длинных анемонотоксинов и проявляют высокую специфичность при связывании с потенциал-зависимыми натриевыми каналами (Nay) электровозбудимых мембран. Большинство нейротоксинов типа 1, выделенных, главным образом, из актиний семейства Actiniidae, содержит 47 аминокислотных остатков (а.о.) (Bosmans, Tytgat, 2007), а нейротоксины типа 2, выделенные из актиний семейства Stichodactylidae, имеют в составе 48 а.о. и, подобно представителям типа 1, три дисульфидных мостика (рис. 1А), локализация которых впервые определена для RTX-III (Зыкова, Козловская, 19896). В пределах одного типа нейротоксинов наблюдается высокая степень структурной гомологии (до 98%), в то время как между нейротоксинами разных типов она не превышает 40% (рис. 2). Характерной особенностью нейротоксинов типа 2 является отсутствие одного а.о. на N-конце последовательности и наличие 3-4 основных остатков на С-конце (рис. 1А). Кроме того, в их аминокислотном составе содержится гораздо больше заряженных и ароматических остатков, что может обуславливать большее сродство нейротоксинов типа 2 к своим мишеням - Nay-каналам различных типов.
Вторичная структура обоих типов нейротоксинов актиний представляет собой антипараллельный четырех-стрендовый b-фолд - уникальный bbbb-тип, обнаруженный только у анемонотоксинов (рис. 1Б, В). Несмотря на некоторые различия аминокислотных последовательностей, идентичное расположение S-S связей и наличие консервативных остатков у нейротоксинов обоих типов позволяет предположить, что они имеют общий анце-стральный ген, который подвергся значительной эволюционной дивергенции (Ishida et al., 1997).
Для понимания механизма взаимодействия нейротоксинов с Nay-каналами различных типов и подтипов необходимо знать не только пространственную структуру полипептидов, но и локализацию функционально важных а.о., а также конформационную устойчивость молекул. В лаборатории проведено первое систематическое исследование структурно-функциональных взаимоотношений нейротоксинов второго типа на примере наиболее токсичного полипептида RTX-III с химически модифицированными аминогруппами заряженных остатков Lys и Arg, N-концевого остатка Gly, модифицированными карбоксильными группами восьми заряженных а.о., включая С-концевой Lys, а также модифицированными остатками Тгр и сульфгидрильными группами (полученными восстановлением S-S связей, стабилизирующих
Рис. 1. А — топология расположения S-S связей в аминокис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.