научная статья по теме БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД ИЗ НАСЕКОМОГО SРHОDRОMАNTIS VIRIDIS, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ И АНТИГРИБКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Химия

Текст научной статьи на тему «БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД ИЗ НАСЕКОМОГО SРHОDRОMАNTIS VIRIDIS, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ И АНТИГРИБКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 508 - 516

УДК 577.127

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД ИЗ НАСЕКОМОГО Sphodromantis viridis, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ И АНТИГРИБКОВЫМ ДЕЙСТВИЕМ: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА*

© 2015 Хади Заре-Зардини1,2,3, Асха Тахери-Кафрани3, Махтаб Ордуей4**, Дейла Эбрахими5, Бехназ Толуейниа6

1 Young Researchers Club, Yazd Branch, Islamic Azad University, Yazd, Iran

2 Department of Pediatric, Hematology, Oncology and Genetics Research Center,

Shahid Sadoughi University of Medical Sciences and Health Services, Yazd, Iran

3 Department of Biotechnology, Faculty of Advanced Sciences and Technologies,

University of Isfahan, Isfahan, Iran 4 Pediatric Endocrinologist, Yazd Diabetes Research Center, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran; fax: +98(351)822-9104, E-mail: mahtab.ordooei@gmail.com

5 Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion, Medicine, Tehran, Iran

6 Department of Biology, Faculty of Sciences, Iranshahr Branch, Payam Noor University of Sistan and Baluchestan, Iranshahr, Iran

7 Biotechnology Department, Agriculture faculty, Ferdowsi University of Mashhad,

Mashhad, Iran

Поступила в редакцию 19.09.14 После доработки 26.11.14

Антимикробные пептиды (АМП) являются компонентами иммунной системы, предохраняющей организм хозяина от инфекции. В данной работе был выделен и охарактеризован новый высокоэффективный АМП из тела богомола Sphodromantis viridis. Этот пептид был очищен методом ЖХВД на обращенной фазе. Последующая масс-спектрометрия показала, что он состоит из 14 аминокислотных астатков (а.о.) и относится к семейству мастопаранов. Пептид был назван мастопаран-S (от лат. Sphodromantis). Продемонстрировано, что мастопаран-S обладает противомикробной активностью по отношению к широкому спектру микроорганизмов (грамположительных и грамотрицательных бактерий и грибов) и является более активным, чем известные антибиотики, например, канамицин. Активность мастопарана-S против грамотрицательных бактерий была выше, чем в отношении грамположительных бактерий. Значения минимальной ингибирую-щей концентрации (MIC) мастопарана-S по отношению к различным бактериям находились в диапазоне 15,1—28,3 мкг/мл, к грибкам — 19,3—24,6 мкг/мл. Помимо противомикробного действия, мастопаран-S обладает и гемолитической активностью, но ее величина по отношению к эритроцитам человека была крайне незначительной. Методом МТТ-тестирования на клетках человека (HeLa) показано, что мастопаран-S обладал цитотоксической активностью in vitro в концентрации >40 мкг/мл, но был неактивен в концентрации <30 мкг/мл. Представленные данные указывают на то, что новый пептид может быть использован в качестве медицинского противомикробного средства для лечения местных инфекций.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антимикробные пептиды, цитотоксичность, Sphodromantis viridis, иммунная система, гемолитическая активность.

Врожденный иммунитет у позвоночных и беспозвоночных животных является важной линией защиты от патогенных микроорганизмов

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-255, 15.02.2015.

** Адресат для корреспонденции.

(бактерий, грибков и вирусов) [1]. В связи с отсутствием адаптивной иммунной системы у насекомых, антимикробные пептиды (АМР) играют решающую роль в борьбе с патогенами и, следовательно, являются важными факторами врожденного иммунитета у этого класса животных. АМП продуцируются клетками жирового тела и крови насекомых в ответ на микробное

инфицирование организма, а затем попадают в гемолимфу.

АМП обладают широким спектром противо-микробного действия [2—4]. Как правило, это короткие пептиды и олигопептиды (<100 а.о.), обычно являющиеся катионами [5—7]. Некоторые виды этих пептидов были выделены из амфибий, рептилий, птиц, млекопитающих и пр. [8—12]. Впервые они были получены в лаборатории Бомана из гемолимфы насекомого Hyalophora cecropia [13]. Из более чем 1,7 млн известных к 2010 г. видов живых существ на планете, включающих животных, наземных растений и водорослей, 1 млн — это насекомые [14]. Подобно другим животным, насекомые обладают врожденной иммунной системой, представленной большим набором антимикробных пептидов [15—17], которые были идентифицированы у различных представителей этого класса [18—21]. Большинство представителей отряда Mantodea, включающего в себя 15 семейств и 2200 видов насекомых [22, 23], относятся к семейству Mantidae, к которому принадлежит и богомол Sphodromantis viridis [24—26]. Есть лишь несколько исследований, посвященных выделению и характеристике антимикробных пептидов из представителей семейства Mantidae [27]. Проведенная работа является попыткой выделить и охарактеризовать новые АМП из богомола Sphodromantis viridis.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экстракция пептидов. Использовали 100 взрослых особей Sphodromantis viridis, отловленных в различных областях Ирана. Перед экстракцией пептидов, насекомые, содержавшиеся в небольших садках, были заморожены в жидком N2 и затем размолоты в порошок. Порошок экстрагировали 1%-ным ТХУ в течение 30 мин на льду, центрифугировали 30 мин при 15 000 g, полученный экстракт лиофилизировали.

Получение пептидов. Для очистки пептидов лиофилизованный экстракт растворяли в минимальном объеме дистиллированной воды и проводили хроматографию методом ЖХВД на полупрепаративной колонке C18 с обращенной фазой. Хроматографию выполняли несколько раз (инжектируемый объем составлял 0,4 мл). Элю-цию проводили с помощью комбинации растворов А (0,1%-ный водный раствор ТФУ) и В (0,098%-ный ТФУ в ацетонитриле) (со скоростью 1 мл/мин в течение 70 мин), постепенно увеличивая долю раствора В с 5 до 65% (скорость нарастания градиента раствора В — 0,86% в мин. Поглощение в элюате регистрировали при 220 нм.

Пептидный состав фракций, соответствующих пикам поглощения, определяли в аликвотах путем их повторной хроматографии на аналитической колонке C18. В каждой фракции определяли антимикробную активность. Все фракции лиофилизировали. Самую крупную фракцию, содержащую антимикробные пептиды, повторно очищали указанным выше методом с той лишь разницей, что скорость нарастания градиента раствором В составила 0,5% в мин.

Антимикробный тест выполняли как было описано в наших предыдущих работах [28, 29]. Микроорганизмы выращивали в 3%-ном (w/v) триптоновом соевом бульоне (TSB) при 37° в течение ночи и определяли концентрацию клеток по поглощению при 620 нм. Для определения антибактериальной активности суспензию бактерий добавляли к 6 мл подстилающей агаровой среды (10 мМ Na-фосфат, 1% (v/v) TSB, 1%-ная агароза, pH 6,5) и помещали в чашки Петри. После застывания агарового слоя в нем формировали лунки диаметром 3 мм, вносили в них образцы тестируемых пептидов и инкубировали в течение 3 ч при 37°. Затем подстилающий агар покрывали слоем покровного агара, обогащенного питательными веществами, и инкубировали в течение ночи при 37°. Антибактериальную активность тестировали, наблюдая за ростом бактерий вокруг сформированных лунок.

Для определения противогрибковой активности суспензию грибка добавляли к 20 мл агаровой среды, содержащей картофельную декстрозу, и помещали в чашки для культивирования микроорганизмов. В застывшей среде формировали 3 мм лунки и заполняли их образцами тестируемых фракций пептидов. Чашки помещали в термостат при 30—35° и наблюдали за ростом грибковой культуры в течение 7 сут.

Минимальную ингибирующую концентрацию пептидов (MIC) определяли следующим образом. Сначала готовили серию разведений тестируемого пептида с концентрациями 0,1—1 мг/мл. Аликвоты по 20 мкл из каждого разведения смешивали с бактериальной суспензией с концентрацией клеток 106 КОЕ/мл. Конечные концентрации пептидов составляли 10, 20, 40, 80 и 100 мкг/мл. Полученную смесь раскапывали в 96-луночные микропланшеты для иммуноферментного анализа и инкубировали 18 ч при 37°. Затем определяли поглощение в лунках при 630 нм с помощью ридера для ИФА и сравнивали с поглощением контрольных образцов, не содержащих пептиды.

Для определения MIC пептидов по отношению к грибкам на каждые 180 мкл декстрозо-агаровой среды Сабуро в лунках 96-луночных микропланшетов добавляли по 10 мкл грибко-

вой суспензии с концентрацией 106 КОЕ/мл и по 10 мкл раствора пептида. Планшеты инкубировали 24 ч при 37°. Значения MIC определяли как минимальную концентрацию пептида, при которой рост бактериальной или грибковой культуры полностью подавлялся. В качестве объектов для исследования были использованы культуры следующих микроорганизмов: Escherichia coli PTCC2433, Klebsiella pneumonia PTCC4231, Pseudomonas aeroginosa PTCC2834, Bacillus subtilis PTCC4533, Leuconostoc mesenteroides PTCC1445, Bacillus cereus PTCC1435, Aspergilus niger, Aspergilus fumigates и Сandida albicans.

Определение гемолитической активности АМП проводили в соответствии с описанным нами ранее методом [28] с использованием свежевы-деленных эритроцитов крови человека.

Определение жизнеспособности клеток. Ци-тотоксическую активность пептидов по отношению к клеткам HeLa определяли с помощью MTT (3 - [ 4, 5 - д им етил тиаз ол - 2 - ил ] - 2, 5 - д и ф е -нилтетразолийбромид)-теста. До начала эксперимента клетки культивировали в 96-луночных планшетах в течение 24 ч. Затем среду сливали и заменяли на свежую, содержащую тестируемый пептид в концентрациях 10—100 мкг/мл, т.е. в таких же количествах, которые были использованы для определения антимикробной активности. (Клетки, культивируемые в отсутствие АМП, были использованы в качестве контроля.) Планшеты инкубировали 30 мин, 3 и 6 ч, а затем в каждую лунку добавляли МТТ в фосфатном буфере PBS в конечной концентрации 5 мкг/мл. Реакцию проводили 4 ч при 37°, жидкость удаляли, а для растворения образовавшихся кристаллов формазана добавляли смесь, содержащую ДМСО (по 200 мкл в лунку). После инкубации в течение ночи при 37° определяли поглощение в лунках при 540 нм на сканере для микропланшетов. Выживаемость клеток рассчитывали как отношение D540 в эксперименте/D^ в к

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»