ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 4, с. 402-408
УДК 579.66
БИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ КСИЛОТРОФНЫМ БАЗИДИОМИЦЕТОМ Lentinula edodes
© 2013 г. Е. П. Ветчинкина*, А. М. Буров*, М. В. Агеева**, Л. А. Дыкман*, В. Е. Никитина*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, 410049 **Казанский институт биохимии и биофизики РАН, Казань, 420111 e-mail: elenavetrus@yandex.ru Поступила в редакцию 05.07.2012 г.
Показано, что лекарственный базидиомицет Lentinula edodes восстанавливал ионы золота из тетра-хлороаурат (III) водорода (тетрахлорозолотая кислота) — HAuCl4 до элементного состояния с образованием сферических наночастиц. При глубинном выращивании культуры в присутствии золото-хлористоводородной кислоты было зафиксировано появление интенсивного сиренево-красного окрашивания мицелиальных гиф L. edodes, что может говорить о восстановлении ионов золота до золотых наночастиц. С использованием методов просвечивающей электронной микроскопии и рентгеновской флуоресценции наблюдали накопление коллоидного золота грибным мицелием в виде электронно-плотных сферических наночастиц диаметром от 5 до 50 нм как на поверхности, так и внутри грибных клеток.
DOI: 10.7868/S0555109913040132
Наночастицы в настоящее время находят широкое применение в медицине (синтез, доставка и утилизация лекарств, лечение рака), биологии (иммунные исследования, использование в качестве биомаркеров при изучении внутриклеточных процессов in vivo) и технологии (электроника, информационные технологии, получение новых материалов с улучшенными свойствами) [1]. Для синтеза наночастиц необходимой формы и размера было разработано множество физико-химических методов, однако несмотря на их успешное применение, они зачастую остаются дорогостоящими и требуют использования опасных химических соединений. Поэтому существует потребность в развитии безопасных для окружающей среды и человека эффективных методов синтеза различных наночастиц с применением, в частности, микробных биотехнологий [2]. О биологическом ("зеленом", green) синтезе наночастиц золота, серебра, селена, платины, кварца и других соединений бактериями, актиномицетами, грибами, дрожжами и вирусами существует достаточно много сообщений, так как в настоящее время проводится активный поиск эффективных биообъектов для получения наночастиц различной химической природы [3—6]. Однако несмотря на стабильность, полученные биологически наночастицы не однородны, а синтез идет достаточно медленно. Чтобы преодолеть эти проблемы, необходимо всестороннее изучение всех факторов, влияющих на данный процесс, таких, как микробиологические методы культивирования, экстракции, ста-
билизации, расшифровка клеточных, биохимических и молекулярных механизмов для увеличения скорости синтеза и улучшения свойств наночастиц.
Кроме того, ввиду очень широкого разнообразия микроорганизмов необходимо вести исследования в направлении выявления новых перспективных объектов и изучения их потенциала как биологического материала для синтеза наноча-стиц. Исследователи отмечают способность к синтезу наночастиц золота и серебра у ряда низших грибов [7, 8]; сообщается также о синтезе наночастиц базидиомицетами Volvariella volvacea [9] и Coriolus versicolor [10], однако данные культуры высших грибов восстанавливали соединения в культуральной жидкости и не были способны к накоплению элементных частиц внутри клеток. Данные литературы о получении наночастиц золота с помощью высших культивируемых базидио-мицетов в настоящее время весьма немногочисленны.
Цель работы — изучение способности высшего целебного базидиомицета Lentinula edodes к синтезу золотых наночастиц и их накопление в мицелии.
МЕТОДИКА
Объект исследования и условия культивирования. Объектом исследования послужил штамм ксилотрофного лекарственного базидиомицета Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке) F-249 из коллекции высших
грибов кафедры микологии и альгологии Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Культуру поддерживали на 4%-ном пивном сусло-агаре при 4°С.
В условиях глубинного культивирования грибную культуру выращивали на синтетической среде состава (г/л): D-глюкоза — 1, L-аспарагин — 0.1, КН2Р04 - 2, К2НР04 - 3, М§804 • 7Н20 - 2.5, Бе804 • 7Н20 — 0.03, рН — 5.8. Культивирование проводили в колбах объемом 100 мл с 50 мл среды при 26°С, как оптимальной температуре роста мицелия для этого вида. В качестве инокулята брали 14-суточную культуру Ь. edodes, выращенную на агаризованной синтетической среде при 26°С.
При исследовании влияния на рост базидио-мицета Ь. edodes золотосодержащего соединения и определении способности ксилотрофа к его восстановлению в жидкую синтетическую среду вносили в виде водного раствора золотохлористо-водородную кислоту НАиС14 ("81§та-АЫг1сИ", США) в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ. Растворы, используемые в качестве добавки к среде выращивания, были внесены в стерильных условиях непосредственно перед посевом отдельно в каждую из колб культивирования.
Определение ростовых характеристик грибной культуры. При глубинном культивировании рост шиитаке характеризовали по накоплению сухой биомассы. Мицелий фильтровали через предварительно взвешенные на аналитических весах фильтры, высушивали до постоянной массы и вновь взвешивали. Сравнивали прирост биомассы (по сравнению с 3-часовыми образцами культуры на данной среде) в контрольном и опытных вариантах.
Опыты по измерению ростовых характеристик и накоплению грибной биомассы проводили в 5— 10 повторностях.
Рентгеновская флуоресценция. Для детектирования элементного золота и (или) соединений золота, содержащихся в мицелии гриба и культуральной жидкости, проводили рентгенофлуоресцентное исследование образцов мицелия и осадка среды культивирования. Для этого культура шиитаке была выращена на синтетической среде (контроль), вышеописанного состава, а также с добавлением 50 мкМ НАиС14 (опыт) при 26°С в течение 14 сут. Далее выращенные образцы мицелия были отмыты от среды культивирования, собраны центрифугированием и высушены при комнатной температуре. Культуральная жидкость была подвергнута лио-филизации. Для обнаружения наночастиц внутри гиф грибной мицелий выращивали вышеописанным способом в присутствии 50 мкМ НАиС14 14 сут, после чего отмывали от среды культивирования дистиллированной водой, собирали центрифугированием и подвергали лиофилизации,
затем грибные гифы механически разрушали и отделяли от элементарных частиц через фильтр Millipore ("Millipore Corp.", США), с диаметром пор 0.22 мкм. Далее наночастицы ресуспендиро-вали в минимальном объеме дистиллированной воды и высушивали на воздухе при 20°С. Анализ содержания золота в сухой биомассе, сухой культуральной жидкости и отфильтрованном метериале проводили с помощью энергодисперсионного спектрометра модели ED 2000 ("Oxford Instruments", Великобритания). Условия измерения были следующими: диапазон определяемых элементов от Na до U, рентгеновская трубка с серебряным анодом, напряжение на трубке 35 кВ, фильтр первичного рентгеновского излучения — тонкий серебряный, экспозиция 600 с, среда — воздух. Содержание определяемых элементов оценивали при помощи метода "фундаментальных параметров", заложенных в программном обеспечении прибора.
Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Образцы культур исследовали при помощи метода негативного контрастирования. Мицелий двукратно отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ): (г/л): NaCl - 8.5, Na2HPO4 • 2H2O - 1.34, NaH2PO4 • 2H2O - 0.39, рН - 7.4, затем дистиллированной водой, предварительно пропущенной через фильтр Millipore (диаметр пор 0.22 мкм). Далее мицелиальные гифы ресуспендировали в минимальном объеме дистиллированной воды и наносили на никелевые сеточки с подложкой (1%-ный раствор формвара в дихлорэтане). После высыхания образца клетки контрастировали 1%-ным водным раствором уранилацетата [11].
Фиксацию грибных гиф для последующего получения ультратонких срезов проводили следующим образом. Мицелиальные гифы L. edodes собирали центрифугированием при 13000 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Материал переносили в полипропиленовые пробирки объемом 2 мл и фиксировали в 0.5%-ном глутаровом альдегиде в течение 3 ч. Дальнейшую фиксацию проводили в растворе 2.5%-ного глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере (0.1 М, pH - 7.2), в течение 12ч. Затем материал выдерживали в 1%-ном растворе OsO4, приготовленном на том же буфере, с добавлением 34 мг/мл сахарозы.
Дегидратацию образцов проводили в серии спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне. Затем препараты выдерживали в окиси пропилена 45 мин, пропитывали эпоксидной смолой ЭПОН и окисью пропилена по 24 ч в следующих соотношениях: 1) 1 : 2, 2) 1 : 1, 3) 2 : 1, и материал помещали в чистую смолу. Полимеризацию проводили при температурах 37°, 45° и 57°С по 24 ч. Ультратонкие срезы получали на микротоме ("LKB-III", Швеция), монтировали на ни-
(а) (б)
Рис. 1. Фотографии колб с культурой базидиомицета L. edodes штамм F-249, выращенной на синтетической среде в отсутствие (а — контроль) и присутствии 50 мкМ HAuCl4 (б) в течение 14 сут при 26°С.
келевые сеточки, окрашивали водным раствором уранилацетата [11] и цитратом свинца [12].
Для изучения наночастиц грибной мицелий выращивали вышеописанным способом в присутствии 50 мкМ золотохлористоводородной кислоты 14 сут, отмывали от среды культивирования дистиллированной водой, собирали центрифугированием и подвергали лиофилизации, затем грибные гифы механически разрушали и отделяли от элементарных частиц через фильтр Millipore (диаметр пор 0.22 мкм). Далее наноча-стицы ресуспендировали в минимальном объеме дистиллированной воды и наносили на никелевые сеточки с подложкой (1%-ный раствор форм-вара в дихлорэтане).
Микрофотографии были получены на электронном микроскопе Libra 120 ("Carl Zeiss", Германия) при 120 кэВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние золотосодержащего соединения (HAuCl4) в среде культивирования на рост L. edodes F-249.
Первоначально была пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.