научная статья по теме БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА LUTEOCOCCUS JAPONICUS SUBSP. CASEI НА ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ Химия

Текст научной статьи на тему «БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА LUTEOCOCCUS JAPONICUS SUBSP. CASEI НА ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ»

УДК 577.112:579.861.043:535.31

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА Luteococcus japonicus subsp. casei НА ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ

© 2014 г. Л. И. Воробьёва*, Е. Ю. Ходжаев*, Н. В. Харченко*, Т. М. Новикова**, Т. А. Чердынцева*

*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119899

e-mail: livorobjeva@mail.ru **Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, 119899

Поступила в редакцию 17.12.2013 г.

Изучено биологическое действие внеклеточного пептидного реактивирующего фактора (РФ), синтезируемого Luteococcus casei, на клетки пробиотических культур. РФ оказывал протекторный и реактивирующий эффект на клетки Bifidobacterium bifidum, подвергаемые действию желчных солей и кислотному стрессу, действовал как криопротектор при лиофилизации и длительном хранении культуры. Показано, что РФ и культуральная жидкость L. casei проявляли бифидогенное действие. Степень защиты и реактивации клеток молочнокислых бактерий, подвергнутых действию желчных солей, зависела от природы штамма. Максимальная степень защиты (более, чем в 13 раз) и реактивации (почти в 3 раза) обнаружена у Lactobacillus casei и минимальная — у Lactobacillus reuterii. Устойчивость лактобацилл к желчи увеличивалась в последовательности Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus и L. reuterii и коррелировала со степенью защиты РФ.

DOI: 10.7868/S0555109914040291

Использование про- и пребиотиков в медицине постоянно увеличивается. Имеется много фактов [1], подтверждающих эффективность применения пробиотиков в целях предотвращения и лечения гастроэнтерологических заболеваний.

Пробиотики определяют [2] как живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах, приносят пользу здоровью хозяина. По определению пробиотики должны быть живыми микроорганизмами, однако неживые микроорганизмы тоже могут проявлять такие полезные эффекты как, связывание канцерогенов в организме хозяина [3] и выступать в качестве антимутагенов [4].

Наиболее широко используемые пробиотики включают штаммы бифидо- и молочнокислых бактерий родов Bifidobacterium и Lactobacillus, а также некоторые непатогенные штаммы, такие, как Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faeciens, Saccharomyces cerevi-siae boulardii и др.

Положительное действие пробиотиков на физиологическое состояние организма-хозяина связывают [5] c образованием органических кислот — продуктов ферментации углеводов, поглощаемых хозяином, с конкуренцией с патогенами, стимуляцией иммунного ответа хозяина, влиянием на настроение, энергетический статус и даже умственные способности [6]. Пробиотики предот-

вращают и помогают при лечении диарреи разной этиологии, что связывают с их "вытесняющим" действием в отношении патогенов [7]. Активность пробиотических микроорганизмов в значительной степени определяется их способностью выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека и колонизировать его отделы. Известно [7], что транзит через ЖКТ сопровождается воздействием на клетки ряда стрессор-ных факторов, таких, как кислотность и пищеварительные ферменты желудка, желчные соли в тонком кишечнике, эффекторы иммунной системы млекопитающих (дефензины и кателициди-ны), повреждающие клетки и снижающие их метаболическое состояние, выживаемость и функциональность.

Ранее [8] было показано, что пептидный реактивирующий фактор (РФ), выделяемый клетками Е. casei, проявляет протекторное и реактивирующее действие в отношении представителей про- и эукариот, подвергаемых действию различных стрессоров.

Цель работы — изучение защитного, реактивирующего, бифидогенного и бактерицидного действия РФ и КЖ Е. casei на пробиотические бактерии ЖКТ человека.

МЕТОДИКА

Объекты исследования и их культивирование.

Молочнокислые бактерии Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L. reuterii, L. acidophilus и L. plan-tarum выращивали в среде MRS ("Fluka", США) в пенициллиновых флаконах на 10 мл в течение 48 ч при 37°C.

Бифидобактерии B. bifidum культивировали в среде следующего состава (%): панкреатический гидролизат казеина — 3.0, экстракт пекарских дрожжей — 0.5, глюкоза — 0.75, лактоза — 0.25, ци-стеин - 0.05, NaCl - 0.25, MgSO4 - 0.05, аскорбиновая кислота — 0.05, ацетат натрия — 0.03, гидролизат рыбной муки — 5.0, твин 80 — 1.0 мл, 50%-ный раствор лактулозы — 5.0 мл, гемин — 5 мг. В плотные среды добавляли 1.5—2.0% агара. В готовых средах воздух замещали до стерилизации аргоном для создания анаэробных условий. Чашки Петри с плотной средой инкубировали в боксе с генераторами анаэробного состояния Genbox 96124 ("bioMerieux", Франция) в течение 7 сут.

Бактерии Luteococcus japonicus subsp. casei выращивали в статических условиях в колбах на 100 мл при 32°C на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза — 1.0; (NH4)2SO4 — 0.3; KH2PO4 — 0.1; Na2HPO4 — 0.2; MgSO4 — 0.002; CaCl2 — 0.002; NaCl — 0.002; дрожжевой экстракт — 0.1; pH 7.0 поддерживали 10%-ным раствором NaOH. Культуральная жидкость (КЖ) L. casei служила источником для выделения РФ.

Для получения тест-системы и изучения бактерицидного действия бифидобактерий в качестве мишеней использовали бактерии Pseudomonas aeruginosae, Salmonella typhii TA-35, Cytrobacter freundii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli, полученные из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ. Бактерии выращивали на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 16—20 ч при 37°C.

Определение бактерицидного действия L. casei.

Тест-культуры пересевали в пробирки с 5 мл МПБ и через 16—20 ч выращивания клетки отделяли центрифугированием и ресуспендировали в физиологическом растворе до конечной плотности культур 0.5 ед. ОП (фильтр № 6, ФЭК 56 ПМ, Россия, кюветы 3 мл). 0.1 мл суспензии переносили в 10 мл полужидкого МПА (0.75% агара), засеянный агар наслаивали на поверхность плотной среды МПА (2% агара) в чашках Петри (10 мл). В среде, засеянной тест-культурой, делали лунки, куда вносили по 100 мкл раствора РФ в 3%-ном растворе NaCl или 100 мкл КЖ культивирование проводили при 37°C. Зоны подавления роста вокруг лунок измеряли через 16—20 ч.

Стрессорные факторы. В качестве стрессорных факторов использовали натриевые соли желчных кислот. Суспензию клеток в физиологическом

растворе инкубировали с равным объемом раствора солей желчных кислот с суммарной конечной концентрацией 2 г/л, рН 7.0, в течение 30 мин при 33°С.

Кислотный стресс создавали путем выдерживания суспензии клеток B. Ыfidum в 0.1 М растворе цитратно-фосфатного буфера, рН 4.0, в течение 10 ч. После чего проводили десятикратные разведения и высевали на чашки Петри с плотной средой. Чашки Петри инкубировали в анаэроста-тах в течение 7 сут. Эффективность защитного или реактивирующего действия оценивали по соотношениям титра КОЕ в суспензиях, инкубированных с РФ до или после экспозиции со стрес-сорным фактором, к титру КОЕ суспензии, подверженной только стрессу.

Определение протекторной и реактивирующей активности РФ. Для получения РФ культуру L. casei в конце фазы экспоненциального роста (48 ч) центрифугировали при 10000 % 20 мин, клетки бактерий промывали и ресуспендировали в 0.05 М №-фос-фатном буфере, рН 7.4. Отделенная от клеток КЖ использовалась для выделения РФ по методу, описанному ранее [9].

Определение выживаемости бифидобактерий после лиофилизации и последующего хранения в отсутств^ и в присутствии криопротекторов. Концентрированную суспензиию клеток (0.2 мл) помещали в стерильную пробирку эппендорфа с ватной пробкой, вносили по 0.1 мл КЖ, РФ, криопротек-тор (К, обезжиренное молоко, содержащее 5%-ную глюкозу и 5%-ную сахарозу), РФ + К. Контролем служила суспензия клеток без внесения дополнительных веществ. Все варианты инкубировали в течение 1 ч, после чего суспензию замораживали в морозильной камере при температуре —20°С и лиофильно высушивали в сушилке 'ХаЪсопсо" (США) при 4.9 Па и температуре конденсатора — 25°С 24 ч. После высушивания ватную пробку эппендорфа заменяли на металлический колпачок. Лиофильно высушенные культуры хранили при 5°С.

Определение бифидогенного действия РФ и

КЖ. Среду для бифидобактерий разливали по 1 мл в пробирки эппендорфа, засевали трехсуточной культурой B. Ыfidum по 10 мкл, вносили РФ в растворе 3%-ной №С1 в количестве 50, 100, 150 или 200 мкл/эппендорф или КЖ L. casei в количестве 50, 100 и 200 мкл/эппендорф. В контрольные варианты вносили 3%-ный раствор №С1 в количестве 100 и 200 мкл/эппендорф или физиологический раствор в тех же количествах.

Статистическая обработка. В работе приведены средние арифметические величины из 3 независимых экспериментов и их стандартные отклонения.

ОД540 2.0

1.5

1.0

0.5

1 _ __ - ■

М' **

- ш s Г

1 1 1

см 2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0 100 200 300

мкл (КЖ или РФ)/ мл

Рис. 1. Влияние РФ и КЖ на рост B. bifidum. 1 - КЖ, 2 - РФ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Бифидогенное действие РФ и КЖ L. casei. Би-

фидобактерии — строго анаэробные, грамполо-жительные бактерии, включены в класс Actino-bacteria. Метагеномные исследования показали [10], что они составляют главную бактериальную популяцию в ЖКТ здоровых людей. Различные штаммы бифидобактерий в качестве источника углерода предпочтительно используют не моносахара, а олиго- и полисахариды [11], что обеспечивает им конкурентное преимущество перед другими группами кишечных бактерий и активную колонизацию кишечного тракта. Ряд штаммов пропионовых бактерий проявляет бифидо-генное действие на некоторые бифидобактерии [12, 13]. Род Luteococcus включен в сем. Propioni-bacteraceae, но отличается от классических про-пионовых бактерий по ряду признаков [14]. Из данных, представленных на рис. 1, видно, что внесение КЖ в количестве 50 и 100 мкл/мл в среды увеличивало более, чем на 50% выход биомассы B. bifidum. Дальнейшее увеличение количества вносимой КЖ приводило к уменьшению накопления биомассы, возможно, за счет снижения рН среды и отрицательно влияло на развитие бифидобактерий. Внесение РФ в питательную среду стимулировало рост культуры (рис. 1), и

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком