УДК 577.112:579.861.043:535.31
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПЕПТИДНОГО ФАКТОРА Luteococcus japonicus subsp. casei НА ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ
© 2014 г. Л. И. Воробьёва*, Е. Ю. Ходжаев*, Н. В. Харченко*, Т. М. Новикова**, Т. А. Чердынцева*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, 119899
e-mail: livorobjeva@mail.ru **Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, 119899
Поступила в редакцию 17.12.2013 г.
Изучено биологическое действие внеклеточного пептидного реактивирующего фактора (РФ), синтезируемого Luteococcus casei, на клетки пробиотических культур. РФ оказывал протекторный и реактивирующий эффект на клетки Bifidobacterium bifidum, подвергаемые действию желчных солей и кислотному стрессу, действовал как криопротектор при лиофилизации и длительном хранении культуры. Показано, что РФ и культуральная жидкость L. casei проявляли бифидогенное действие. Степень защиты и реактивации клеток молочнокислых бактерий, подвергнутых действию желчных солей, зависела от природы штамма. Максимальная степень защиты (более, чем в 13 раз) и реактивации (почти в 3 раза) обнаружена у Lactobacillus casei и минимальная — у Lactobacillus reuterii. Устойчивость лактобацилл к желчи увеличивалась в последовательности Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus и L. reuterii и коррелировала со степенью защиты РФ.
DOI: 10.7868/S0555109914040291
Использование про- и пребиотиков в медицине постоянно увеличивается. Имеется много фактов [1], подтверждающих эффективность применения пробиотиков в целях предотвращения и лечения гастроэнтерологических заболеваний.
Пробиотики определяют [2] как живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах, приносят пользу здоровью хозяина. По определению пробиотики должны быть живыми микроорганизмами, однако неживые микроорганизмы тоже могут проявлять такие полезные эффекты как, связывание канцерогенов в организме хозяина [3] и выступать в качестве антимутагенов [4].
Наиболее широко используемые пробиотики включают штаммы бифидо- и молочнокислых бактерий родов Bifidobacterium и Lactobacillus, а также некоторые непатогенные штаммы, такие, как Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faeciens, Saccharomyces cerevi-siae boulardii и др.
Положительное действие пробиотиков на физиологическое состояние организма-хозяина связывают [5] c образованием органических кислот — продуктов ферментации углеводов, поглощаемых хозяином, с конкуренцией с патогенами, стимуляцией иммунного ответа хозяина, влиянием на настроение, энергетический статус и даже умственные способности [6]. Пробиотики предот-
вращают и помогают при лечении диарреи разной этиологии, что связывают с их "вытесняющим" действием в отношении патогенов [7]. Активность пробиотических микроорганизмов в значительной степени определяется их способностью выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) человека и колонизировать его отделы. Известно [7], что транзит через ЖКТ сопровождается воздействием на клетки ряда стрессор-ных факторов, таких, как кислотность и пищеварительные ферменты желудка, желчные соли в тонком кишечнике, эффекторы иммунной системы млекопитающих (дефензины и кателициди-ны), повреждающие клетки и снижающие их метаболическое состояние, выживаемость и функциональность.
Ранее [8] было показано, что пептидный реактивирующий фактор (РФ), выделяемый клетками Е. casei, проявляет протекторное и реактивирующее действие в отношении представителей про- и эукариот, подвергаемых действию различных стрессоров.
Цель работы — изучение защитного, реактивирующего, бифидогенного и бактерицидного действия РФ и КЖ Е. casei на пробиотические бактерии ЖКТ человека.
МЕТОДИКА
Объекты исследования и их культивирование.
Молочнокислые бактерии Lactobacillus casei, L. rhamnosus, L. reuterii, L. acidophilus и L. plan-tarum выращивали в среде MRS ("Fluka", США) в пенициллиновых флаконах на 10 мл в течение 48 ч при 37°C.
Бифидобактерии B. bifidum культивировали в среде следующего состава (%): панкреатический гидролизат казеина — 3.0, экстракт пекарских дрожжей — 0.5, глюкоза — 0.75, лактоза — 0.25, ци-стеин - 0.05, NaCl - 0.25, MgSO4 - 0.05, аскорбиновая кислота — 0.05, ацетат натрия — 0.03, гидролизат рыбной муки — 5.0, твин 80 — 1.0 мл, 50%-ный раствор лактулозы — 5.0 мл, гемин — 5 мг. В плотные среды добавляли 1.5—2.0% агара. В готовых средах воздух замещали до стерилизации аргоном для создания анаэробных условий. Чашки Петри с плотной средой инкубировали в боксе с генераторами анаэробного состояния Genbox 96124 ("bioMerieux", Франция) в течение 7 сут.
Бактерии Luteococcus japonicus subsp. casei выращивали в статических условиях в колбах на 100 мл при 32°C на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза — 1.0; (NH4)2SO4 — 0.3; KH2PO4 — 0.1; Na2HPO4 — 0.2; MgSO4 — 0.002; CaCl2 — 0.002; NaCl — 0.002; дрожжевой экстракт — 0.1; pH 7.0 поддерживали 10%-ным раствором NaOH. Культуральная жидкость (КЖ) L. casei служила источником для выделения РФ.
Для получения тест-системы и изучения бактерицидного действия бифидобактерий в качестве мишеней использовали бактерии Pseudomonas aeruginosae, Salmonella typhii TA-35, Cytrobacter freundii, Staphylococcus aureus и Escherichia coli, полученные из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии МГУ. Бактерии выращивали на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 16—20 ч при 37°C.
Определение бактерицидного действия L. casei.
Тест-культуры пересевали в пробирки с 5 мл МПБ и через 16—20 ч выращивания клетки отделяли центрифугированием и ресуспендировали в физиологическом растворе до конечной плотности культур 0.5 ед. ОП (фильтр № 6, ФЭК 56 ПМ, Россия, кюветы 3 мл). 0.1 мл суспензии переносили в 10 мл полужидкого МПА (0.75% агара), засеянный агар наслаивали на поверхность плотной среды МПА (2% агара) в чашках Петри (10 мл). В среде, засеянной тест-культурой, делали лунки, куда вносили по 100 мкл раствора РФ в 3%-ном растворе NaCl или 100 мкл КЖ культивирование проводили при 37°C. Зоны подавления роста вокруг лунок измеряли через 16—20 ч.
Стрессорные факторы. В качестве стрессорных факторов использовали натриевые соли желчных кислот. Суспензию клеток в физиологическом
растворе инкубировали с равным объемом раствора солей желчных кислот с суммарной конечной концентрацией 2 г/л, рН 7.0, в течение 30 мин при 33°С.
Кислотный стресс создавали путем выдерживания суспензии клеток B. Ыfidum в 0.1 М растворе цитратно-фосфатного буфера, рН 4.0, в течение 10 ч. После чего проводили десятикратные разведения и высевали на чашки Петри с плотной средой. Чашки Петри инкубировали в анаэроста-тах в течение 7 сут. Эффективность защитного или реактивирующего действия оценивали по соотношениям титра КОЕ в суспензиях, инкубированных с РФ до или после экспозиции со стрес-сорным фактором, к титру КОЕ суспензии, подверженной только стрессу.
Определение протекторной и реактивирующей активности РФ. Для получения РФ культуру L. casei в конце фазы экспоненциального роста (48 ч) центрифугировали при 10000 % 20 мин, клетки бактерий промывали и ресуспендировали в 0.05 М №-фос-фатном буфере, рН 7.4. Отделенная от клеток КЖ использовалась для выделения РФ по методу, описанному ранее [9].
Определение выживаемости бифидобактерий после лиофилизации и последующего хранения в отсутств^ и в присутствии криопротекторов. Концентрированную суспензиию клеток (0.2 мл) помещали в стерильную пробирку эппендорфа с ватной пробкой, вносили по 0.1 мл КЖ, РФ, криопротек-тор (К, обезжиренное молоко, содержащее 5%-ную глюкозу и 5%-ную сахарозу), РФ + К. Контролем служила суспензия клеток без внесения дополнительных веществ. Все варианты инкубировали в течение 1 ч, после чего суспензию замораживали в морозильной камере при температуре —20°С и лиофильно высушивали в сушилке 'ХаЪсопсо" (США) при 4.9 Па и температуре конденсатора — 25°С 24 ч. После высушивания ватную пробку эппендорфа заменяли на металлический колпачок. Лиофильно высушенные культуры хранили при 5°С.
Определение бифидогенного действия РФ и
КЖ. Среду для бифидобактерий разливали по 1 мл в пробирки эппендорфа, засевали трехсуточной культурой B. Ыfidum по 10 мкл, вносили РФ в растворе 3%-ной №С1 в количестве 50, 100, 150 или 200 мкл/эппендорф или КЖ L. casei в количестве 50, 100 и 200 мкл/эппендорф. В контрольные варианты вносили 3%-ный раствор №С1 в количестве 100 и 200 мкл/эппендорф или физиологический раствор в тех же количествах.
Статистическая обработка. В работе приведены средние арифметические величины из 3 независимых экспериментов и их стандартные отклонения.
ОД540 2.0
1.5
1.0
0.5
■
1 _ __ - ■
М' **
- ш s Г
1 1 1
см 2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 100 200 300
мкл (КЖ или РФ)/ мл
Рис. 1. Влияние РФ и КЖ на рост B. bifidum. 1 - КЖ, 2 - РФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Бифидогенное действие РФ и КЖ L. casei. Би-
фидобактерии — строго анаэробные, грамполо-жительные бактерии, включены в класс Actino-bacteria. Метагеномные исследования показали [10], что они составляют главную бактериальную популяцию в ЖКТ здоровых людей. Различные штаммы бифидобактерий в качестве источника углерода предпочтительно используют не моносахара, а олиго- и полисахариды [11], что обеспечивает им конкурентное преимущество перед другими группами кишечных бактерий и активную колонизацию кишечного тракта. Ряд штаммов пропионовых бактерий проявляет бифидо-генное действие на некоторые бифидобактерии [12, 13]. Род Luteococcus включен в сем. Propioni-bacteraceae, но отличается от классических про-пионовых бактерий по ряду признаков [14]. Из данных, представленных на рис. 1, видно, что внесение КЖ в количестве 50 и 100 мкл/мл в среды увеличивало более, чем на 50% выход биомассы B. bifidum. Дальнейшее увеличение количества вносимой КЖ приводило к уменьшению накопления биомассы, возможно, за счет снижения рН среды и отрицательно влияло на развитие бифидобактерий. Внесение РФ в питательную среду стимулировало рост культуры (рис. 1), и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.