ЭКОЛОГИЯ, 2007, № 3, с. 185-190
УДК 579.26.266:579.222
БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ НИТРИЛМЕТАБОЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ АНТРОПОГЕННО-ИЗМЕНЕННЫХ ПОЧВ ПЕРМСКОГО КРАЯ
© 2007 г. В. Ä. Демаков, Ä. Ю. Максимов, М. В. Кузнецова, Г. В. Овечкина, Н. Б. Ремезовская, Ю. Г. Максимова
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН 614081 Пермь, ул. Голева, 13 E-mail: maks@iegm.ru Поступила в редакцию 01.03.2006 г.
Исследовано разнообразие бактерий, метаболизирующих нитрилы карбоновых кислот, в антропогенно-измененных почвах Пермского края. Разработаны эффективные способы селективного выделения культур, обладающих нитрилгидратазной и нитрилазной активностями. Установлено, что основная часть микроорганизмов, способных утилизировать нитрилы, представлена грамположи-тельными нокардиоформными бактериями рода Rhodococcus. Изоляты, обладающие детектируемой нитрилазной активностью, были представлены также и грамотрицательными формами (грам-отрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки, роды Pseudomonas, Azomonas, Azo-tobacter, Acidovorax). Две ферментные системы гидролиза нитрилов имели 27% культур. Нитрил-гидратазная и нитрилазная активности исследованных штаммов превышали аналогичную ферментативную активность бактерий, выделенных из почв естественной среды, что свидетельствует о процессах естественной селекции сапрофитной микрофлоры, проходящих в химически измененной почве.
Ключевые слова: биоразнообразие, нитрилгидратаза, амидаза, нитрилаза.
Нитрилы карбоновых кислот (органические цианиды) - соединения, содержащие одну или несколько цианогрупп -C=N, связанных с органическим радикалом. Акрилонитрил и другие органо-цианиды - высокотоксичные соединения, распространенные антропогенные загрязнители окружающей среды (Акрилонитрил, 1987). Микроорганизмы, активно утилизирующие нитрилы, являются важнейшим фактором детоксикации нитрильных загрязнений и перспективным объектом для локальной очистки стоков. Штаммы, использующие нитрилы и амиды в качестве ростового субстрата, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Pseudomonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Bacillus, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. (Asano, 2002; Banerjee et al., 2002). Их распространение, по-видимому, связано с тем, что некоторые нитриль-ные соединения относятся к промежуточным продуктам метаболизма или распада тканей у растений и других организмов (Sibbesen et al., 1995).
Для бактерий характерны два основных пути метаболизма нитрилов: 1) одностадийный гидролиз, осуществляемый ферментом нитрилазой (КФ 3.5.5.1) с образованием соответствующей кислоты; 2) гидратация ферментом нитрилгидра-тазой до амида (КФ 4.2.1.84) с последующим гид-
ролизом амидазой (КФ 3.5.1.4) амида до кислоты (Knowles, Collins, 1983). Ферменты метаболизма нитрилов разных микроорганизмов отличаются по структуре, термо- и pH-стабильности, специфичности. Отдельные штаммы-продуценты нит-рилгидратаз (P. chlororaphis B23, R. rhodochrous J1, M8, R312, Rhodococcus sp. N774) успешно используются для промышленного производства акриламида и других амидов карбоновых кислот (Kobayashi et al., 1992; Вейко и др., 1995; Cowan et al., 1998).
Известно, что в почвах с химической нагрузкой активно размножаются и накапливаются бактерии, способные усваивать загрязняющие вещества (Watanabe, 1987). В связи с этим представляет интерес изучение биологического разнообразия микрофлоры антропогенно-измененной среды и оценка ресурсов микроценозов для биотехнологии.
Цель настоящей работы - морфологическая и биохимическая характеристика микроорганизмов, активно метаболизирующих нитрилы карбоновых кислот в химически измененных почвах, отобранных на территории предприятий Пермского края.
Рис. 1. Карта отбора проб. Масштаб 1 : 8000000.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Образцы загрязненных акрилонитрилом почв отбирали в районе промышленных предприятий ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова", г. Пермь, и ОАО "Бератон", г. Березники Пермской области
(рис. 1). Для выделения и выращивания бактерий применяли минеральную безазотную солевую среду N следующего состава (г/л): KH2PO4 1.0, K2HPO4 • 3H2O 1.6, NaCl 0.5, MgSO4 • 7H2O 0.5, CaCl2 • 2H2O 0.005, FeSO4 • 7H2O 0.01, CoCl2 • 6H2O
0.01, pH 7.2-7.4. В качестве источника углерода и азота использовали ацетонитрил или изобутиро-нитрил в концентрации 10 мМ. Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл при температуре 28°C и постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин. Рост культуры бактерий оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при X = 540 нм с учетом разведения. Одна единица ОП540 соответствует 0.42 мг сухого веса клеток. Для отбора высокоактивных нитрилазных штаммов полученные культуры выращивали в чашках Петри с минимальной агаризованной средой, содержащей 1% ацетонитрила и 10 мМ хло-рацетамида - селективного агента, вызывающего гибель клеток, обладающих выраженной амидаз-ной активностью (Clarke, Tata, 1973).
Идентификацию бактерий проводили на основании культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик (Определитель..., 1997).
Трансформацию нитрилов с использованием биомассы выделенных штаммов проводили в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации нитрила 2%. Реакция протекала параллельно при 25 и 50°С в течение 10 мин и останавливалась добавлением концентрированной HCl до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали спек-трофотометрически, методом газовой хроматографии и ВЭЖХ.
Для определения субстратной специфичности нитрилгидратаз и амидаз изучаемых штаммов нитрилы или амиды вносили в буферную среду, содержащую бесклеточные экстракты культур, до концентрации 100 мМ. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-4 пятикратной обработкой по 20 с на льду. Обломки клеточных стенок осаждали на микроцентрифуге 5415 D (Eppendorf) при 14 тыс. об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость использовали для энзиматических исследований.
Анализ продуктов трансформации нитрилов проводили на газовом хроматографе Chrom 5d ("LP", Чехословакия), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографиче-ская колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем поли-сорб-1, фракция 0.25 - 0.5 мм ("Реахим", Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата 190 ± ± 3°С, температура испарителя 220 ± 10°С. В качестве стандартов использовали растворы чистых нитрилов, амидов и карбоновых кислот (рис. 2).
Нитрилгидратазную и нитрилазную активности клеток определяли по изменению в реакционной среде концентрации амида и кислоты в
100
200 Время, с
300
400
Рис. 2. Разделение методом ГХ стандартных образцов акрилонитрила (1), акриловой кислоты (2), ацетами-да (3) и акриламида (4).
течение 10 мин. Удельную активность фермента выражали в мкмоль продукта реакции (амида или кислоты), образуемого за 1 мин, в пересчете на 1 мг веса сухих клеток (мкмоль/мг/мин).
Количественный анализ метаболитов конверсии 3-цианопиридина и бензонитрила проводили методом ВЭЖХ при использовании жидкостного хроматографа 'ЪКВ Вготша" (Швеция), оснащенного ультрафиолетовым детектором модели S-П. Хроматографическая колонка длиной 250 мм и внутренним диаметром 4.6 мм была заполнена Lюhrosorb RP-18 104. Условия проведения анализа: подвижная фаза метанол: Н3Р04 (60 : 40), скорость потока 1.25 мл/мин, давление 91 ± 1 бар. Количественные измерения были получены при сравнении со стандартной кривой известных концентраций исследуемых соединений.
ПЦР-анализ генов нитрилгидратаз и нитрилаз описан ранее (Кузнецова и др., 2004).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка соотношения представителей разных родов бактерий, метаболизирующих нитрилы, показала, что в целом среди бактерий, обладающих как нитрилгидратазной, так и нитрилазной активностью, преобладают нокардиоподобные актиномицеты (группа 22), главным образом из рода Rhodococcus (77 и 54% соответственно). Штаммы, обладающие детектируемой нитрилазной активностью, представлены также и грамот-рицательными формами (грамотрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки). Две ферментные системы гидролиза нитрилов имели 27% исследованных культур. Из 14 образ-
4
1
0
Таблица 1. Конверсия ацетонитрила и акрилонитрила выделенными штаммами микроорганизмов
Культура Ацетамид, мкмоль/мг/мин Ацетат натрия, ммоль/г/ч Акриламид, мкмоль/мг/мин Акриловая кислота, ммоль/г/ч
штамм* род, вид 25°С 50°С 25°С 50°С 25°С 50°С 25°С 50°С
К10Ж1 R. luteus 0 0 3 4 0 0 0 0.1
К10Ж2 Pseudomonas sp. 0.2 0 0 4 1 0.1 0.8 1.5
К10Ж2р R. rhodochrous 2 0 0 6 204 13 0 2
К10Б R. erythropolis 0.1 0 0 12 1.1 0 0 0.2
К10Р1 Nocardia sp. 0 0 1 16 0 0 0 4.2
К10р Nocardia sp. 25 0 0 0 25.7 0 0 0
К100М R. erythropolis 0.2 0 0 2 0.3 0 0 0
К12Б Azomonas sp. 0 0 2.3 0.1 0 0 4 3
К12Ч Azotobacter sp. 0 0 4 1 0 0 0 0
К13-13 Acidovorax sp. 0.5 0 0 1.4 1 0.5 0 0
К17Ж P. fluorescens 1.5 0.4 0 0 0 0 0 0
К17Р R. rhodochrous 10 145 0 0 0 0 0 0
К15-6 Azomonas sp. 0 0 0 2.3 0 0 0.6 0.1
Б2-4 R. erythropolis 0 0 12 0.6 0 0 0 0
Б4-4а Rhodococcus sp. 48.8 0 0 0 50 0 0 0
Б4-4 R. erythropolis 0 0 10.2 4 0 0 127 65
Б5-4 R. erythropolis 5.2 0 0 5 8 2 0 12
Б5-9 Pseudomonas sp. 0 0 0.93 9.07 0 0 0 0
Б20-8 R. erythropolis 0 0 0.9 0.3 0 0 20 6
А0 R. erythropolis 180 240 0 0 121 165 0 0
* К... - культура изолирована из образцов почв ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова", Б... и А0 - выделены из почвы с территории ОАО "Бератон".
цов загрязненных акрилонитрилом почв, взятых на территории промышленных предприятий ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова" и ОАО "Бератон", изолированы 42 характерные культуры бактерий, способные использовать изобутиронитрил в качестве единственного источника углерода и энергии. Установлено, что из 22 культур грампо-ложительных бактерий 14 принадлежат к роду Rhodococcus (из них 10 - R. erythropolis, 3 -R. rhodochrous, 1 - R. luteus), 4 - Microbacterium, 2 -Citreobacterium, 1 - Nocardia и 1 - Aureobacterium. Грамотрицательные микроорганизмы,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.