БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 829 - 844
УДК 577.152.1
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК
Обзор
© 2015 Г.Ю. Ломакина, Ю.А. Модестова, Н.Н. Угарова*
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-2660, электронная почта: nugarova@gmail.com
Поступила в редакцию 16.01.15
Рассмотрены теоретические аспекты биолюминесцентного метода определения аденозинтрифосфата (АТР), основанного на использовании люциферин-люциферазной системы светляков, и его применение для детекции жизнеспособности клеток в микробиологии, санитарии, медицине и экологии. Описаны различные подходы к анализу индивидуальных и смешанных культур микроорганизмов, показаны возможности метода для изучения биологических процессов в живых клетках, в том числе некроза, апоптоза, а также для изучения динамики метаболизма.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: биолюминесценция, люцифераза светляков, АТР, внутриклеточный АТР, лизис клеток, внеклеточный АТР, лиофилизованные вакцины.
ОБЩИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО АТР
АТР как показатель жизнеспособности клеток.
Аденозинтрифосфат (систематическое название 9-р-В-рибофуранозиладенин-5'-трифосфат, или 9-р-В-рибофуранозил-6-амино-пурин-5'-трифосфат) — нуклеотид, трифосфорный эфир аденозина, который является производным аде-нина и рибозы (АТР), служит главным носителем химической энергии в клетках всех живых существ (млекопитающих, микроорганизмов, растений и др.) [1]. При гидролизе АТР происходит отщепление одной или двух остатков фосфорной кислоты, которое сопровождается выделением энергии. В клетке АТР передает энергию другим молекулам, гидролизуясь при этом до своих низкоэнергетических аналогов (АДР и/или АМР), которые в свою очередь вновь получают энергию, присоединяя фосфатные группы и превращаясь в АТР. Содержание внутриклеточного АТР является основным индикатором жизнеспособности клеток. При гибели клеток, в первую очередь, прекращается синтез АТР, в то время как гидролиз АТР может некоторое время продолжаться, поэтому содержание внутриклеточного АТР быстро падает вплоть до нулевых значений. Содержание АТР в жизнеспо-
* Адресат для корреспонденции.
собных клетках микроорганизмов достаточно высоко — от 500 до 10 000 мкг на 1 г сухой биомассы [2] или от 10-19 до 10-15 моль АТР в одной клетке. Оно может варьировать в зависимости от природы и размера клеток, и энергетического состояния. На любые стрессовые воздействия клетка отвечает изменением содержания внутриклеточного АТР. В зависимости от условий содержания культуры концентрация внутриклеточного АТР также может изменяться, однако физиологические изменения, не приводящие к гибели клеток, не превышают 10—50 раз. На примере индивидуальных штаммов микроорганизмов показано, что для суспензии клеток в стандартных условиях содержание внутриклеточного АТР пропорционально концентрации клеток в суспензии [3]. Таким образом, измеряя концентрацию внутриклеточного АТР, можно оценить содержание жизнеспособных клеток в образце.
Измерение концентрации АТР биолюминесцентным методом. Существуют различные методы измерения концентрации АТР: ферментативные со спектрофотометрической детекцией, радиоактивные, хроматографические и др. Наиболее чувствительным, быстрым и специфичным является метод биолюминесцентной АТР-метрии. Еще в 1940-е гг. было показано, что в реакции биолюминесценции, катализируемой ферментом — люциферазой светляков, необходимым и обязательным компонентом является АТР [4].
Суммарная реакция в люциферин-люциферазной системе светляков описывается следующей схемой:
Люцифераза светляков
D-люциферин + О2 + АТР + Mg+2 —> ^ оксилюциферин + АМР + PPi + + квант света (~560 нм).
Согласно этой схеме органический субстрат (люциферин) в присутствии АТР и ионов магния быстро окисляется кислородом воздуха до оксилюциферина, при этом образуются пиро-фосфат (PPi) и АМР. Оксилюциферин первоначально образуется в электронно-возбужденном состоянии, при переходе продукта в основное состояние выделяется квант видимого света. Достоинствами люциферазы светляков является ее абсолютная специфичность по отношению к АТР и высокий квантовый выход свечения (~0,5 — самый высокий среди известных биолюминесцентных систем) [5].
Для регистрации биолюминесценции используются специальные приборы — люмино-метры, впервые появившиеся на рынке в 1970-е гг. Первые люминометры были основаны на технологии, разработанной для измерения радиоактивного излучения — жидкостных сцинтилля-ционных счетчиков [6]. Постепенно был разработан другой подход — в современных приборах для детекции люминесцентного сигнала используется счетчик фотонов в комбинации с высокопроизводительными фотоумножителями (ФЭУ). Важно отметить, что сигнал, регистрируемый люминометром, пропорционален, но не равен числу фотонов, испускаемых образцом. Этот сигнал имеет размерность «относительные люминесцентные единицы» (relative luminescent units, RLU). Его абсолютное значение определяется параметрами конкретного прибора и может быть различным даже для люминометров одной модели [7]. Регистрируемая в относительных единицах (RLU) интенсивность света пропорциональна концентрации АТР в линейном диапазоне 10 фМ — 1 мкМ АТР. Современные лю-минометры весьма разнообразны и отличаются друг от друга по целому ряду параметров: по чувствительности, по типу (кюветные или планшетные люминометры), по размеру и сложности конструкции (стационарные и портативные), по наличию или отсутствию инжектора (т.е. предназначенные для измерения постоянной (glow) и импульсной (flash) люминесценции) и т.д. В России выпускается портативный люми-нометр ЛЮМ-1 — высокочувствительный счет-
чик фотонов, который регистрирует интенсивность люминесценции в интервале от 10 до 800 тыс. имп/с, имеет интерфейс для связи с компьютером (рис. 1). По чувствительности и стабильности работы люминометр ЛЮМ-1 не отличается от приборов такого же класса фирмы «Berthold Detection Systems GmbH», Германия.
В продаже начали появляться и универсальные приборы, способные работать в нескольких режимах — регистрировать люминесцентный сигнал, флуоресценцию и абсорбцию. Выбор подходящего прибора для проведения анализа в значительной степени определяет точность получаемых результатов.
Для унификации анализа десятки зарубежных фирм предлагают реагенты для биолюминесцентного определения АТР, так называемые АТР-реагенты. Это лиофилизованные смеси, содержащие все компоненты, необходимые для протекания люциферазной реакции (люцифе-разу, люциферин, соль магния, компоненты буферного раствора, стабилизаторы), за исключением АТР. Перед использованием лиофилизованные АТР-реагенты реконструируют, добавляя специальный раствор для реконструкции АТР-реагента. В России разработаны АТР-реа-генты на основе российской люциферазы Lucióla mingrelica [8, 9]. В эти реагенты входит мутант-ная рекомбинатнтная люцифераза, которая значительно превосходит природную люциферазу по активности и термостабильности [10, 11]. Чувствительность современных биолюминесцентных тест-систем позволяет регистрировать атто-
Рис. 1. Портативный люминометр ЛЮМ-1 («Люмтек», Россия)
молярные количества АТР в образце и выявлять единичные клетки микроорганизмов [12]. Для количественного измерения внутриклеточного АТР клетки лизируют для высвобождения АТР, полученный экстракт вносят в кювету люмино-метра, добавляют АТР-реагент и измеряют интенсивность свечения. Чтобы рассчитать точную концентрацию АТР в образце обычно используется метод контроля с использованием стандартного препарата АТР (АТР-контроль) с точно известным количеством лиофилизован-ного АТР. АТР-контроль обычно поставляется вместе с АТР-реагентом. АТР-контроль реконструируют экстрагентом, который используется для лизиса клеток в образце, и далее измеряют интенсивность свечения. Метод пропорции позволяет рассчитать концентрацию АТР в анализируемом образце.
Важным этапом при количественном определении жизнеспособности микробных клеток является построение градуировочной зависимости между концентрацией внутриклеточного АТР и концентрацией клеток в образце. Для этого используются данные стандартного микробиологического метода посева разведений — классический метод контроля жизнеспособности микробных клеток. С помощью стандартного метода определяют содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл), а с помощью биолюминесцентного метода содержание АТР в 1 мл образца. Получают линейные корреляционные зависимости видаy = а + Ьх: (конц. АТР, моль/мл) = = a + Ь х (КОЕ/мл), которые затем используют для нахождения величины (КОЕ/мл) по величине (конц. АТР, моль/мл). Для индивидуальных культур хорошая линейная корреляция между концентрацией АТР и КОЕ/мл наблюдается в интервале от 103 до 108 КОЕ/мл (рис. 2).
Биолюминесцентный метод позволяет быстро и количественно определять содержание АТР, поэтому он нашел применение в различных областях молекулярной биологии, санитарии, медицины, клинической диагностики, пищевой промышленности и экологии и пр. Возможности и особенности использования биолюминесцентного метода для определения уровня жизнеспособных клеток микроорганизмов, рассмотрены ниже.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АТР В ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КУЛЬТУРАХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Внутриклеточный АТР недоступен для лю-циферазы, поскольку фермент не проникает через мембрану внутрь клеток. Для экстракции внутриклеточного АТР используются реагенты, которые либо увеличивают проницаемость мембран клеток, либо их разрушают. Выбор того или иного лизирующего агента во многом определяется природой анализируемых клеток и задачами конкретного анализа. Экстрагенты, используемые в АТР-метрии, должны отвечать следующим требованиям: 1) должны быстро экстрагировать АТР; 2) инактивировать внутриклеточные ферменты, участвующие во взаимопревращениях адениловых нуклеотидов клетки; 3) сохранять неизменным начальный уровень внутриклеточного АТР в процессе хранения и анализа экстракта; 4) не оказывать инги-бирующего действия на люциферазную реакцию в процессе измерения АТР.
Для экстракции АТР могут быть испол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.