научная статья по теме БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ [13C]/[12C] ОТНОШЕНИЙ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБНЫХ ПРОДУКТОВ ПРИ БИОДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ Химия

Текст научной статьи на тему «БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ [13C]/[12C] ОТНОШЕНИЙ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБНЫХ ПРОДУКТОВ ПРИ БИОДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 497-507

УДК 579.222

БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ [13C]/[12C] ОТНОШЕНИЙ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРОБНЫХ ПРОДУКТОВ ПРИ БИОДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ

© 2014 г. А. М. Зякун*, Е. С. Бродский**, Б. П. Баскунов*, В. Н. Захарченко*, В. П. Пешенко*, А. Е. Филонов*, А. А. Ветрова*, А. А. Иванова*, А. М. Боронин*

*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область, 142290

e-mail: zyakun@ibpm.pushchino.ru **Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцева РАН, Москва, 119071

e-mail: admin@sevin.ru Поступила в редакцию 1.11.2013 г.

Проведен сравнительный анализ данных, полученных с использованием стандартных методов количественного определения углеводородов (экстракционный газо-хромато-масс-спектрометриче-ский, экстракционный ИК-спектроскопический и экстракционно-гравиметрический), которые позволяют оценить степень биоремедиации почв, загрязненных нефтью. Различия в распределении стабильных изотопов углерода (С/12С) нефти и почвенного органического вещества были использованы в качестве природной изотопной "метки" этих веществ. Показано, что при оценке степени биоремедиации почв наиболее информативным методическим подходом является экстракционно-гравиметрический метод в сочетании с характеристиками изотопного состава углерода органических продуктов в почве до и после биоремедиации. В настоящее время этот подход можно рассматривать как единственный метод, который позволяет определить общее количество углеводородов и почвенного органического вещества в загрязненной нефтью почве, а также их содержание, остававшееся в почве после биоремедиации, и количество углеводородов, трансформированных микроорганизмами в органические продукты.

DOI: 10.7868/S055510991404031X

В настоящее время загрязнения нефтью и нефтепродуктами почвенных и водных экосистем могут достигать опасных размеров [1]. В большинстве случаев разливы нефти, загрязняющие почвы и водоемы, происходят при добыче, хранении, транспортировке и переработке нефти [2, 3]. Идентификация источников и оценка масштабов разливов нефти и нефтепродуктов являются важной частью работ, обеспечивающих контроль загрязнений и выбор технологии ремедиации окружающей среды.

Нефть состоит из огромного числа разнообразных органических продуктов (алифатические, алициклические, ароматические углеводороды и гетероатомные соединения), количественное содержание которых различается в зависимости от источников происхождения нефти [4]. Наряду с этим нефть как антропогенный поллютант, характеризуется наличием специфических маркеров, которые могут быть использованы в качестве диагностических признаков источников происхождения нефти и нефтепродуктов [5, 6].

Известно, что состав сырой нефти, попавшей в окружающую среду, может существенно изме-

няться вследствие действия физических, химических и биологических факторов [7]. Особенно трудно предсказуемыми являются изменения состава нефти при воздействии почвенной микро-биоты, поскольку часть микроорганизмов (например грамположительные актиномицеты родов Rhodococcus, Gordonia и Nocardia) использует в качестве субстрата преимущественно алифатические углеводороды [8, 9], а другая часть, принадлежащая родам Pseudomonas, Micobacterium, Dietzia и Bacillus, — ароматические и полиароматические углеводороды [10, 11]. Это приводит к существенному изменению исходного состава нефти. После длительного нахождения нефти в почвенных или водных экосистемах (старых разливах нефти) остаются фракции нефти, которые недоступны в качестве источников питания для аборигенных почвенных микроорганизмов. В таких случаях снижение содержания нефти в почве за счет деятельности почвенной микробиоты может быть достигнуто путем внесения минеральных и/или органических добавок (биостимуляция) [12], а также специальных культур микроорганизмов, способных использовать в качестве субстратов

4

497

наиболее устойчивые полициклические и полиароматические углеводороды нефти (биоаугментация) [13].

Потребление нефти и нефтепродуктов в почвах включает ряд процессов, в результате которых часть углеводородов трансформируется в органические компоненты микробных клеток (анаболические процессы), а часть расходуется на энергетические затраты, сопровождаемые образованием метаболической СО2 (катаболические процессы). В дальнейшем нефтепродукты, трансформируемые в биомассу микробных клеток и органические экзометаболиты, используются как субстраты другими микроорганизмами, не обладающими способностью метаболизировать углеводороды нефти. Одной из важных задач при оценке степени биодеградации углеводородов нефти (в особенности ее старых разливов) является выбор адекватных методов определения количества разлитой нефти и ее потребления микроорганизмами.

Известные в настоящее время методы (экстрак-ционно-гравиметрический (ЭГМ) [14], экстрак-ционно-газо-хроматографический (ЭГХ) [15] и/или хромато-масс-спектрометрический (ХМС) [16] и экстракционно-ИК-спектроскопический (ЭИКС) [17]), позволяют регистрировать отдельные фракции нефти, которые экстрагируются специальными растворителями. Все эти методы основаны на предположении, что общее количество анализируемой нефти пропорционально содержанию отдельных ее фракций. Следовательно, определение содержания нефти по количеству углеводородов в экстрактах предусматривает использование соответствующих калибровочных образцов, таких, как сырая нефть, нефть старых разливов, специальные смеси углеводородов и др.

При определении степени микробной деградации углеводородов нефти в почвенных или водных экосистемах выбор и использование калибровочных смесей углеводородов является крайне сложной процедурой. Во-первых, неизвестно соотношение количеств экстрагируемых и не экстрагируемых фракций нефти, в особенности в старых ее разливах. Во-вторых, после биоремедиации возможно дополнительное образование экстрагируемых углеводородов в результате микробной трансформации фракций нефти, до этого не про-экстрагированных растворителями. Последнее обстоятельство может служить источником ошибок при оценке эффективности биодеградации нефтяных загрязнений почв и водоемов используемыми методами. В связи с этим поиск методов определения суммарного содержания нефтепродуктов, а также их отдельных фракций непосредственно в анализируемых системах (почва и водоемы) является крайне важной и актуальной задачей.

Ранее было показано, что соотношение распределения стабильных изотопов углерода (13С/12С) различается для углеводородов нефти и почвенного органического вещества (ПОВ), что позволяет использовать их в качестве природной изотопной "метки" [18]. Так как изотопный состав углерода нефти отличается от углерода ПОВ, то следует полагать, что на основе изотопного анализа углерода возможно определение остаточных углеводородов нефти и углеводородов, трансформированных микроорганизмами в органические продукты, и ПОВ в загрязненной нефтью почве.

Цель работы — выяснение возможности использования отношение распределения 13С/12С изотопов в нефти и ПОВ в качестве специфического индикатора биодеградации нефти и нефтепродуктов в почвенных экосистемах, а также применение этих данных для оценки степени трансформации углеводородов нефти в микробную биомассу и органические экзометаболиты, которые могут быть доступны микроорганизмам, не способным метаболизировать углеводороды нефти в загрязненных почвах.

МЕТОДИКА

В качестве анализируемого объекта использовали нефтешлам, который содержал смесь ПОВ глинистой почвы и углеводородов старых разливов нефти на площади 195 м2. и глубине 50 см. Минеральная компонента нефтешлама — 75.5 ± 0.2%, температура в пределах 10—24°С, величина рН от 8.8 до 8.3 в зависимости от микробной активности в почве. Для создания пористости и условий, обеспечивающих рост аэробных микроорганизмов, нефтешлам смешивали с лузгой подсолнечника в отношении 40 : 1. Анализируемые образцы нефтешлама просеивали через сито с отверстиями 2 мм и удаляли лузгу. Учитывая сравнительно небольшие количества проб нефтешлама (не более 10 мг), которые использовали при масс-спек-трометрическом изотопном анализе углерода, составление средней пробы имело определяющее значение для получения адекватной изотопной характеристики.

Средние пробы до и после биоремедиации неф-тешлама готовили следующим образом: по 5 г измельченных образцов, отобранных из 5 разных мест площади, загрязненной нефтью, наносили на стеклянную поверхность размером 100 х 100 мм, делили на 100 ячеек и из каждой отбирали около 10 мг. В результате этого была составлена средняя проба около 1 г на образец, которая использовалась для дальнейшего анализа. Среднюю пробу нефтешлама сушили при комнатной температуре до постоянной массы.

Количество бактерий в нефтешламе определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ), используя методику стандартных серийных разведений и высева на агаризованную среду LB [19]. В дополнение к аборигенной микробиоте в неф-тешлам вносили биопрепарат, который содержал бактерии Pseudomonas putida, несущие плазмиды биодеградации ароматических углеводородов нефти, и Rhodococcus erythropolis, продуцирующие биоэмульгаторы и окисляющие преимущественно алифатические углеводороды. Количество первоначально интродуцированных в почву бактерий составляло около 2 х 107 КОЕ/г почвы.

Содержание изотопов углерода 13C и 12C в суммарных органических продуктах, в углеводородах нефти, экстрагированных гексаном, и в ПОВ неф-тешлама были измерены на изотопном масс-спектрометре Breath MAT ("Thermo Finnigan", Германия), соединенном с газовым хроматографом через интерфейсное устройство ConFlow. Анализ изотопного состава углерода органического вещества проводили после сжигания образцов до СО2 в вакуумированных ампулах при 560°C в присутствии окиси меди.

Для количественной характеристики содержания изотопов 13C и 12C в анализируемых образцах использовали отношения интенсивностей пиков

с m/z 45 (13C16O+) и 44 (12C16O+) в масс-спектре СО2. Количество 13C изотопа углерода определяли в относительных единицах (S13C

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком