научная статья по теме БИОСЕНСОРНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГЕПАРИНА Биология

Текст научной статьи на тему «БИОСЕНСОРНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГЕПАРИНА»

СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2015, том 29, № 1, с. 84-92

БИОСЕНСОРЫ

УДК 612.821.8; 591.185

БИОСЕНСОРНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГЕПАРИНА

© 2015 г. С. Г. Скуридин, Ф. В. Верещагин1, В. И. Салянов, В. М. Гусев1, М. А. Павлов1, О. Н. Компанец1, Ю. М. Евдокимов

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

119991 Москва, ул. Вавилова, 32 1Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт спектроскопии РАН 142190 Москва, Троицк, ул. Физическая, 5 E-mail: lancet-bio@bk.ru

Поступила в редакцию 11.09.2014г.

На базе дихрометра СКД-2МУФ, приспособленного для работы с биодатчиком на основе на-ноконструкций ДНК, создана портативная тест-система (оптический биосенсор) медицинского назначения. Тест-система предназначена для определения наличия и концентрации гепарина в лабораторных растворах и лекарственных препаратах, содержащих гепарин. Показано, что биосенсор позволяет измерять концентрацию гепарина в аналитической пробе в интервале от 0.5 до 5.0 мкг/мл.

Ключевые слова: холестерическая жидкокристаллическая дисперсия ДНК, наноконструкции ДНК, круговой дихроизм, гепарин, биодатчик, биосенсор.

ВВЕДЕНИЕ

Гепарин - кислый мукополисахарид, синтезируемый в организме человека и животных тучными клетками. Полисахаридные цепи молекулы гепарина имеют молекулярную массу от 5000 до 30000 Да и состоят из остатков глюкуроновой кислоты и глюкозамина. Тот факт, что молекула гепарина содержит в своем составе значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп, свидетельствует о том, что гепарин является сильным полианионом, способным к образованию комплексов со многими природными и синтетическими соединениями, несущими положительный заряд (Chemistry and biology of heparin and heparan sulfate, 2005).

Основным свойством гепарина является анти-коагуляционное действие, которое объясняется его способностью ингибировать ключевой фермент свертывания крови - тромбин и препятствовать образованию тромбов (Нарушения реакций образования тромбина, 1988). Это обстоятельство определяет широкое использование гепарина в медицинской практике.

Цель настоящей работы - создание недорогой и компактной тест-системы, позволяющей контролировать качество и концентрацию гепарина в лабораторных растворах и лекарственных препаратах, используемых в условиях клиники, а также оценивать соответствие этих препаратов сертификатам российских и зарубежных поставщиков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Использовали дополнительно очищенный от примесей и деполимеризованный препарат двух-цепочечной (дц) ДНК из тимуса крупного рогатого скота (Sigma, США) с молекулярной массой ~(0.6-0.8) х 106 Да.

Нативность ДНК после деполимеризации контролировали по величине гиперхромного эффекта (~ 30-35%), сопровождающего кислотную денатурацию дц нуклеиновых кислот.

Концентрацию ДНК в водно-солевых растворах определяли спектрофотометрически, пользуясь известным значением молярного коэффициента поглощения (е2584 = 6600 М-1 см-1).

Препараты полиэтиленгликоля (ПЭГ; Serva, Германия; молекулярная масса ПЭ 4000 Да) и ан-трациклинового антибиотика дауномицина (ДАУ; Sigma, США) использовали без дополнительной очистки.

Концентрацию ДАУ в исходном растворе определяли спектрофотометрически, пользуясь значением его молярного коэфициента поглощения (б475 = 12000 М-1 см-1) (Gabbay et al., 1976). Исходный раствор ДАУ хранили при 4 °С в светонепроницаемом контейнере и использовали не ранее, чем через сутки после приготовления.

Растворы ДНК, ПЭГ и NaCl готовили на 0.002 М №+-фосфатном буфере (рН ~ 7.0), а затем фильтровали для удаления возможных механических загрязнений через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0.8 мкм.

Раствор СиС12 (0.1 М) готовили, растворяя навеску CuCl2*2H2O (Aldrich, США) в дистиллированной воде, и далее использовали для приготовления 0.001 М раствора СиС12.

Холестерическую жидкокристаллическую дисперсию (ХЖКД) ДНК в ПЭГ-содержащем водно-солевом растворе формировали при помощи методики, подробно описанной в работе (Yevdokimov et al., 1992).

Биодатчик на основе наноконструкций ДНК получали в соответствии с трехстадийной методикой, описанной в работе (Евдокимов и др., 2010).

В работе использованы два препарата гепарина: 6-й Международный стандарт нефрак-ционированного гепарина (NIBSC code: 07/328) (предоставлен Международной Лабораторией биологических стандартов ВОЗ (Национальный Институт биологических стандартов и контроля, Великобритания)) и препарат Na-соли гепарина из слизистой оболочки кишечника свиньи с молекулярной массой от 15000 до 20000 Да (Serva, Германия).

Первый препарат гепарина использовали для градуировки (калибровки)биосенсора, а второй -для проведения собственно измерений концентрации гепарина в аналитических пробах в автоматическом режиме.

Исходные растворы гепарина (С ~ 2 мг/мл) готовили, растворяя его навески в дистиллированной воде.

Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра Cary 100 Scan (Varian, США), а спектры кругового дихроизма (КД) -при помощи портативного дихрометра СКД-2

(Компанец, 2004). Во всех случаях использовали прямоугольные кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см.

Спектры КД представляли в виде зависимости разности интенсивностей поглощения лево- и правополяризованного света (ДА = (AL - Ак)) от длины волны (А,).

Методика иммобилизации частиц наноконструкций ДНК на поверхности ядерных мембранных фильтров, а также аппаратура, использованная для изучения морфологии этих частиц, подробно описаны в работе (Евдокимов и др., 2013а).

Кинетику разрушения биодатчика на основе наноконструкций ДНК под действием гепарина регистрировали по изменению амплитуды аномальной полосы, генерируемой биодатчиком в спектре КД на длине волны 510 нм. Для этого использовали программу "Кинетика", входящую в программное обеспечение портативного дихро-метра СКД-2. Измерения проводили по следующей схеме. Оптическую кювету, содержащую 2 мл биодатчика на основе наноконструкций ДНК, выдерживали в течение 5 мин в термоста-тируемом кюветном отсеке дихрометра при 22 °С для достижения равновесного состояния. Затем в кювету добавляли небольшой объем (0.5; 1; 2; 3; 4 мкл) исходного раствора гепарина. Полученную в оптической кювете смесь перемешивали и приступали к регистрации кинетической кривой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При создании тест-системы для определения концентрации гепарина в жидкости было необходимо решить две основные задачи: сконструировать биодатчик, меняющий свои оптические свойства при взаимодействии с молекулами гепарина; создать портативный измеритель, специально приспособленный для работы с такими биодатчиками.

Биодатчик на основе наноконструкций ДНК. Биодатчик для определения концентрации гепарина в жидкости был создан при помощи метода наноконструирования на основе частиц жидкокристаллической дисперсии ДНК (Уеуёоктоу et а1., 2012). Основную идею этого метода можно сформулировать следующим образом. "Молекулы ДНК в составе частицы ХЖКД находятся в "растворимом" состоянии и между этими молекулами имеется "свободное" пространство. Молекулы "гостей" могут "сшить" соседние молекулы ДНК. В результате процесса "сшивания" может сформироваться объединенная

Рис. 1. Схематические изображения наномостиков между двумя двухцепочечными молекулами ДНК (а) и гипотетической структуры наноконструкции ДНК (б). а - Схематическое изображение структуры искусственных наномостиков, сформированных между соседними молекулами дц ДНК (ДНК 1 и ДНК 2), фиксированными в пространственной структуре частицы ХЖКД: а-1 - структура хелатного комплекса (ДАУ-Си2+); а-2 - вид сверху на соседние молекулы ДНК, "сшитые" на-номостиком;

а-3 - вид сбоку на молекулы ДНК, "сшитые" наномостиками (для удобства изображения наномостики повернуты на 90о по отношению к их реальному положению). б - Гипотетическая структура наноконструкции, созданной на основе дц молекул ДНК, фиксированных в пространственной структуре частицы ХЖКД.

(интегрированная) структура, содержащая все молекулы ДНК, упорядоченные в составе частицы ХЖКД. Для этой новой пространственной структуры будут характерны две особенности: очень высокая молекулярная масса и очень низкая диффузионная подвижность молекул ДНК".

В связи с этим наноконструкция (биодатчик) представляет собой частицу ХЖКД, в составе

которой образующие ее линейные дц молекулы ДНК "сшиты" искусственными наномостиками (Евдокимов и др., 2013б).

Схематическое изображение структуры искусственных наномостиков, сформированных между соседними молекулами ДНК в составе частицы ХЖКД, и гипотетическая структура наноконструкции ДНК представлены на рис. 1,а и б. В соответствии со схемой, приведенной на рис. 1,а, наномостик состоит из чередующихся молекул антибиотика антрациклиновой группы - дауно-мицина (ДАУ) и ионов двухвалентной меди. В состав наномостика входят шесть атомов меди(П) и пять молекул ДАУ (Никифоров и др., 2005).

На рис. 2,а приведены изображения частиц наноконструкций ДНК, полученные при помощи атомно-силового микроскопа. Видно, что форма частиц наноконструкций ДНК близка к сфероцилиндрической, а их средний размер лежит в пределах от 400 до 500 нм. Результаты, представленные в нижней части рис. 2,а, свидетельствуют о том, что частицы наноконструкций ДНК имеют среднюю высоту около 500 нм. Расчеты, проведенные на основании данных о морфологии частиц на-ноконструкций ДНК, показали, что одна частица содержит приблизительно 104 молекул ДНК.

Образование наноконструкции ДНК сопровождается возникновением в спектре КД двух аномальных полос (рис. 2,б), первая из которых расположена в УФ (X = 270 нм), а вторая - в видимой области спектра (X = 510 нм).

Было показано, что искусственный наномостик содержит в своем составе структурный элемент, чувствительный к действию гепарина. Таким структурным элементом являются молекулы ДАУ (Евдокимов и др., 2011). Гепарин, образуя комплекс с молекулами ДАУ, "экстрагирует" антибиотик из состава наномостиков. Этот процесс сопровождается разрушением наномостиков и, как

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»