СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2012, том 26, № 3, с. 246-255
БИОСЕНСОРЫ
УДК 602.4:628.35:664
БИОСЕНСОРНЫЙ ЭЛЕКТРОД НА ОСНОВЕ КОМПОЗИЦИИ "ПОЛИВИНИЛОВЫЙ СПИРТ - N-ВИНИЛПИРРОЛИДОН" ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА
© 2012 г. В. А. Арляпов, Н. Ю. Юдина, С. В. Алферов, Л. Д. Асулян, В. А. Алферов, А. Н. Решетилов1
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тульский государственный университет ", 300600 Тула, пр. Ленина, 92 1Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Московская обл., г. Пущино, пр-т Науки, 5
E-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru
Поступила в редакцию 03.04.2012 г.
Амперометрический биосенсор для оценки индекса БПК (биохимического потребления кислорода) формировали иммобилизацией дрожжевых клеток Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 в поливиниловый спирт, модифицированный N-винилпирролидоном; полученную рецепторную мембрану фиксировали на электроде типа Кларка. Комбинирование полимеров позволило получить сенсорные элементы, сохраняющие жизнеспособность в течение длительного времени и имеющие высокую чувствительность и стабильность. Для субстратов, которые могут присутствовать в сточных водах (спирты, углеводы, карбоновые кислоты, аминокислоты, нитрофенолы и поверхностно-активные вещества), показана высокая окислительная активность сенсорного элемента и отсутствие токсического эффекта со стороны анализируемых соединений. Получена оценка диапазона измерения и области линейной зависимости сигналов от уровня БПК. Определена рН- и температурная чувствительность, зависимости сигналов от концентрации солей, стабильность, кинетические константы Михаэлиса, скорость анализа. Показана высокая степень корреляции значений БПК, определенных при помощи предлагаемого биосенсора, со значениями БПК, оцененными стандартным методом разбавления при измерении образцов сточных вод.
Ключевые слова: биосенсор, биохимическое потребление кислорода, БПК, сточные воды, дрожжи Debaryomyces hansenii.
ВВЕДЕНИЕ
Биохимическое потребление кислорода (БПК) является одним из наиболее широко используемых показателей при контроле чистоты водных сред. БПК - это количество кислорода, необходимое для биохимического окисления органических веществ, содержащихся в образце. Традиционная методика определения БПК требует инкубирования насыщенной кислородом пробы в течение 5, 10 или 20 сут (БПК5, БПК10 или БПК20, соответственно). Альтернативой являются экспрессные методы определения БПК при помощи биосенсорных анализаторов, основанные на использовании клеток микроорганизмов, способных окислять широкий спектр органических соединений (Bourgeois et al., 2001). Клетки микроорганизмов - это
один из наиболее перспективных, полифункциональных сенсорных элементов для потенциальной аналитической системы. Принципиальным отличием метода анализа БПК с использованием биосенсора от традиционного метода является значительное, с 5 сут до 10 - 20 мин, сокращение времени анализа.
В настоящее время разработано много лабораторных моделей и промышленно выпускаемых биосенсорных анализаторов БПК (Понаморева и др., 2011). Биосенсоры позволяют производить определение БПК в среднем в диапазоне 2-300 мг/л за время порядка нескольких минут. Однако значительное количество публикаций, выходящих регулярно по данной тематике, свидетельствует о
том, что еще не получены характеристики, соответствующие требованиям потребителей.
Актуальными проблемами разработки БПК-сенсоров являются повышение чувствительности анализа, увеличение времени жизни биоматериала в рецепторных элементах биосенсоров, сложные требования по обслуживанию и недостаточная устойчивость применяемых культур микроорганизмов к тяжелым металлам и различным токсическим веществам (Seo et al., 2009). Решение описанных выше проблем может осуществляться, с одной стороны, подбором штаммов микроорганизмов, обладающих широкой субстратной специфичностью и высокой устойчивостью к действию токсичных веществ, содержащихся в сточных водах. С другой стороны, поиск может быть направлен на разработку новых методов иммобилизации биоматериала, обеспечивающих длительное время функционирования биосенсора при сохранении высокой активности биокатализатора.
Дрожжи являются наиболее предпочтительным биоматериалом для разработки БПК-био-сенсоров, поскольку устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать в рецепторном элементе биосенсора длительное время (Dhall et al., 2008). Наиболее часто при создании биосенсоров для анализа биохимического потребления кислорода используются дрожжи родов Trichosporon (Jianbo et al., 2003), Arxula (Lehmann et al., 1999; Арляпов и др., 2008), Saccharomyces (Seo et al., 2009; Nakamura et al., 2007) и Issatchenkia (Heim et al., 1999). Перспективными микроорганизмами для использования в БПК-биосенсорах являются дрожжи рода Debary-omyces. Согласно имеющимся данным, дрожжи Debaryomyces hansenii обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества (Арляпов и др., 2010). Известно также, что дрожжи D. hansenii устойчивы к высоким концентрациям солей (Prista et al.,
2005). Представленные особенности позволяют предположить, что эти микроорганизмы могут быть эффективно использованы при разработке БПК-биосенсора, обладающего высокой точностью и устойчивостью к воздействию негативных факторов окружающей среды.
Наиболее перспективным методом иммобилизации целых клеток микроорганизмов для использования в БПК-биосенсорах является их включение в гели различного состава (Guisan,
2006). Данный метод позволяет разрабатывать биосенсоры, при помощи которых можно проводить длительное по времени измерение без существенного снижения активности. Еще одно
важное преимущество использования иммобилизации состоит в возможности поставлять потребителям готовые рецепторные элементы. Так, разработан биосенсор на основе клеток Arxula adeninovorans, иммобилизованных в геле поли-карбомоилсульфоната, который позволял определять БПК в диапазоне 2-550 мг/дм3 и был стабилен в течение 40 сут (Lehmann et al., 1999). На основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включенных в альгинат кальция, разработан биосенсор, при помощи которого получены результаты, коррелирующие с результатами, полученными стандартным методом (R > 0.95) (Seo et al., 2009). Известно несколько лабораторных моделей БПК-биосенсоров, содержащих целые клетки микроорганизмов, иммобилизованных в золь-гель матрицы различного состава (Chen et al., 2002; Jianbo et al., 2003). Такие матрицы имеют высокую проницаемость для анализируемых проб, хорошую прочность и стабильность, а также низкую токсичность по отношению к иммобилизованным микроорганизмам. Однако получение таких препаратов представляет довольно сложную задачу, так как большинство методов образования золь-гелей основаны на температурной обработке смеси реагентов (Guisan, 2006).
Перспективным методом иммобилизации целых клеток микроорганизмов является их включение в гель на основе поливинилового спирта (ПЕС). ПЕС химически и микробиологически стабилен, нетоксичен и биосовместим (Marks et al., 2007), что обуславливает эффективное использование полимера в качестве матрицы для иммобилизации клеток микроорганизмов. Однако для применения в рецепторных элементах биосенсорных анализаторов ПЕС мало пригоден, так как в виде тонких пленок обладает очень низкой механической прочностью. Известны методики получения механически устойчивых пленок ПЕС в результате УФ-об-лучения (Арляпов и др., 2006), воздействия борной кислоты (Wang et al., 2010) и сополимеризации с N-винилпиридином. Описанные методы сопряжены с использованием реагентов или условий реакции, оказывающих негативное влияние на живые микроорганизмы и приводящих к снижению чувствительности биосенсора.
Новым подходом при иммобилизации микроорганизмов для создания распознающих элементов биосенсоров является использование N-винил-пирролидона для модификации ПЕС (Алферов и др., 2011). N-винилпирролидон не только практически нетоксичен, но и повышает активность некоторых микроорганизмов (Демаков и др., 2008). Использование N-винилпирролидона для модификации ПЕС позволяет значительно повысить долговременную стабильность получаемых
рецепторных элементов при сохранении высокой чувствительности и широкой субстратной специфичности (Алферов и др., 2011).
Цель данной работы - создание и изучение характеристик амперометрического БПК-биосен-сора на основе дрожжей штамма Debaryomyces hansenii BKM Y-2482, иммобилизованных в пленку поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием рН-метр-иономер-БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1, сопряженного с персональным компьютером, работающим под управлением специализированного программного обеспечения EXP2PR (ООО "Эконикс-эксперт", Россия), позволяющего проводить регистрацию и обработку сигналов сенсоров. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (мг/дм3 • мин). Датчиками служили кислородные электроды типа Кларка (ООО "Кронас", Россия) с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6.8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200-1000 мкл, 20-200 мкл, 0.5-10 мкл, Biotech, США). В качестве модельной использовали смесь глюкозы и глютаминовой кислоты в массовом соотношении 1:1 (ГГС), которую при-
меняют как стандарт при определении БПК5 в Российской Федерации и международной практике. В соответствии с нормативной документацией принимали, что БПК5, равное 205 мг/дм3, соответствует раствору, содержащему 150 мг/дм3 глюкозы и 150 мг/дм3 глутаминовой ки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.