ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 268-274
УДК 543.9+57.087.9+541.13+579.6
БИОСЕНСОРЫ И БИОТОПЛИВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ: ИССЛЕДОВАНИЯ, ОРИЕНТИРОВАННЫЕ НА ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ (ОБЗОР)
© 2015 г. А. Н. Решетилов
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино Московской области, 142290
e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию: 22.05.2014 г.
Обсуждаются работы по созданию биосенсорных анализаторов микробного и ферментного типов, а также микробных биотопливных элементов для потенциального практического применения.
Ключевые слова: биосенсоры, микробные клетки, ферменты, детекция токсичных соединений, биотопливные элементы, наноматериалы, модификация электродов.
DOI: 10.7868/S055510991502018X
От создания первого ферментного биосенсора и начала биосенсорных исследований как таковых прошло около 60 лет. В настоящее время это направление аналитической биотехнологии, которое кратко можно назвать биосенсорикой, развилось в междисциплинарную науку и объединяет специалистов широкого профиля. Хотя работы по биосенсорам основаны на проведении фундаментальных исследований, большинство из них ориентировано на конечное прикладное использование. В целом, биосенсорная продукция занимает устойчивое положение на рынке и широко используется в медицине, экологическом контроле, биотехнологии.
Рассматриваются собственные новые разработки по биосенсорам и биотопливным элементам, а также анализируются данные по развитию новых направлений в этой области, представленных в публикациях отечественных и зарубежных авторов.
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЦЕЛЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК
Легкоокисляемые соединения. Биосенсоры для детекции этилового спирта и глюкозы необходимы для медицины, пищевой промышленности и многих областей биотехнологии, где требуется быстрое и точное определение содержания этих соединений. Подобные вопросы ранее были рассмотрены в работах [1, 2], в которых был дан глубокий анализ использования двух ферментов — алкогольдегидрогеназы (АДГГ) и алкогольокси-дазы (АО) для анализа алифатических спиртов. Фактически, описанные там способы составляют не только основу многих существующих в настоящее время биосенсорных подходов, но и позволяют осуществлять дальнейшие шаги по совер-
шенствованию параметров. Так, в работах [3, 4] был проведен сравнительный анализ характеристик биосенсоров на основе клеток метилотроф-ных дрожжей и алкогольоксидазы, используемых для определения содержания этанола. Для создания биосенсоров в качестве основы биорецепторов были использованы 3 диких штамма дрожжей Р1еЫа ащш(а, мутантный штамм НатвпШа ро1у-шогрНа МСУС 495 1п и АО, выделенная из этого штамма. Наиболее эффективным оказался биосенсор на основе штамма Р. ащш(а ВКМ У-2518. Биосенсоры на основе АО и Р. ащш(а ВКМ У-2518 практически не обладали чувствительностью к углеводам и органическим кислотам, однако при детекции этанола мешает метанол. Нижний предел детекции по этанолу для биосенсора на основе штамма Р. ащт(а ВКМ У-2518 составил 0.012 мМ, а на основе АО — 0.05 мМ. Для микробного и ферментного биосенсоров рН-оп-тимум был 7.2—7.6 и 7.8—8.8, соответственно. Операционная стабильность биосенсора на основе АО составила 4 сут, на основе штамма Р. ащш(а ВКМ У-2518 — 5 сут. Биосенсор, созданный на основе Р. ащш(а ВКМ У-2518, может быть использован для детекции этанола в алкогольных напитках, биологических жидкостях и при оптимизации ферментационных процессов.
Поскольку способ иммобилизации в значительной степени определяет чувствительность и время жизни биосенсора, были исследованы характеристики рецепторных элементов для анализа этанола на основе дрожжей Н. ро1ушогрка МСУС 4951п, иммобилизованных адсорбцией на стекловолокне и модифицированной бензохиноном и ДЭАЭ-дектстраном на нитроцеллюлозной мембране. Линейный диапазон определения этанола для биорецептора на основе дрожжей, адсорбиро-
ванных на стекловолокне, составил 0.05—1.18 мМ и 0.2—1.53 мМ для биорецептора на основе дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране. Показано, что каждый тип биорецептора обладает определенными преимуществами в эксплуатации. Результаты определения этилового спирта, полученные с использованием биосенсоров на основе H. polymorpha 4951п, иммобилизованного обоими способами, коррелировали с данными, полученными стандартным ареометрическим методом [5]. Следует отметить, что использованные способы иммобилизации удовлетворяют условиям закрепления клеток и являются более простыми для формирования биосенсоров первого поколения, чем способы иммобилизация в проводящие полимеры, например в полипиррол. Обобщающие данные по иммобилизации такого типа, которая используется для создания биосенсоров второго и третьего поколения, можно найти в обзоре [6].
Некоторые типы амперометрических биосенсоров основаны на использовании графитопасто-вых электродов, содержащих медиаторы электронного транспорта. Биосенсоры такого типа позволяют исследовать роль медиаторов, повышающих их чувствительность по сравнению с биосенсорами на основе электрода Кларка. Была показана возможность применения штамма Glu-conobacter oxydans 8Ъ8р. МшМш ВКМ В-1280 в графитопастовом электроде в сочетании с водо-нерастворимыми медиаторами — ферроценом, 1,1'-диметилферроценом, 2,5 -дибром-1,4-бензо-хиноном, 2-метил-1,4-бензохиноном, для реализации процесса электрокаталитического окисления глюкозы [7]. Оказалось, что для обеспечения высокой каталитической активности наиболее эффективным является 2,5-дибром-1,4-бензохинон. Для этого медиатора отношение максимальной скорости реакции к кажущейся константе Миха-элиса было наиболее высоким по сравнению с другими медиаторами. Исследованию водорастворимых медиаторов были посвящены другие работы, в которых было показано, что такие медиаторы, как ацетилферроцен, ферроценкарбальдегид, 2,5-диб-ром-1,4-бензохинон и 2-метил-1,4-бензохинон могут быть использованы для детекции сахаров и спиртов [8—10].
Известно, что при исследовании биотехнологических процессов методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) можно осуществлять неинвазив-ный мониторинг рН, ионного состава, концентрации субстратов и метаболитов микроорганизмов. Важной особенностью метода является то, что в случае микробных клеток не требуется их специальной пробоподготовки. Была изучена трансформация сорбита бактериальным штаммом G. oxydans БиЪзр. suboxydans методом 1Н-ЯМР спектроскопии. Анализ 1Н-ЯМР спектров позволил обнаружить, что в результате окисления D-сорбита образуется
L-сорбоза. При исследовании фосфорсодержащих компонентов методом 31Р-ЯМР был обнаружен только неорганический фосфат, который накапливался в среде в результате лизиса клеток [11].
При производстве алкогольных напитков необходимо выполнять оперативную оценку содержания в среде глюкозы, этанола и метанола [12]. Для этой цели можно использовать биосенсоры [13]. Вместе с тем важным является то, что высокоселективная детекция данного вещества при таком методе определения не всегда обязательна. Так, например при наличии неселективной биосенсорной детекции, которая является типичной в случае использования микробных сенсоров, можно объединить биосенсорный анализ с математическим методом, основанным на применении искусственных нейронных сетей; такое сочетание позволяет производить селективное определение содержания компонентов в смеси глюкоза—этанол—метанол [14]. Технология искусственных нейронных сетей позволила осуществить селективный анализ этой смеси в диапазоне концентраций каждого из субстратов от 1.0 до 5.0 мМ. Было показано, что при использовании нейронных сетей относительная ошибка определения концентрации веществ находилась в пределах 2—33%. Эта работа явилась развитием более ранних исследований, показавших эффективность данного подхода [15].
Бактерии рода Gluconobacter широко используются в разнообразных биотехнологических процессах, в частности, при производстве уксуса и уксусной кислоты из спиртосодержащих продуктов. На начальной стадии ферментационного процесса в ферментере находится максимальное количество этилового спирта (около 10%), которое снижается в процессе роста содержания уксусной кислоты. Снижение концентрации этилового спирта до определенного уровня свидетельствует о завершении процесса. Был предложен способ биосенсорной оценки процесса производства уксусной кислоты по содержанию спирта в ферментере. Способ был основан на том, что бактерии рода Gluconobacter не окисляют уксусную кислоту, но при этом скорость окисления этилового спирта не зависит от концентрации уксусной кислоты. Биосенсор на основе бактерии Gluconobacter позволял определять содержание этилового спирта в диапазоне 0.0125-2.00 мМ (0.0006-0.0092%). Проведена оценка содержания этилового спирта в пробах промышленно полученного уксуса различных производителей [16].
Биосенсорная детекция ксенобиотиков. Детекция ксенобиотиков необходима при мониторинге окружающей среды для ее сохранения и защиты здоровья человека. Было показано, что микробный биосенсор, основанный на клетках, содержащих плазмиду деградации е-капролактама, мо-
жет являться важным инструментом для его обнаружения в объектах окружающей среды [17, 18]. Оценка возможности биосенсорного определения токсичных компонентов, которые могут попадать на предметы ежедневного обихода — одежду, обувь, посуду, игрушки и другие товары народного потребления из полимерных и прочих материалов приведена в работе [19]. Для определения токсичности товаров был создан микробный биосенсор на основе бактерий рода Pseudomonas и непатогенных штаммов бактерии Escherichia coli. Были установлены закономерности изменения дыхательной активности этих микроорганизмов в присутствии токсикантов, мигрирующих в водные вытяжки из продукции бытового назначения. Результаты, полученные при использовании биосенсора на основе штамма E. coli K-12, представляются наиболее интересными и перспективными для оценки токсичности товаров; можно предположить возможность оценки острой и хронической токсичности.
Поскольку поверхностно-активные вещества (ПАВ), использующиеся в народном хозяйстве,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.