ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 70, № 7, с. 675-685
= ОБЗОРЫ
УДК 575+577.152.1
БИОСЕНСОРЫ КАК СРЕДСТВО МОНИТОРИНГА ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НЕРВНО-ПАРАЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
© 2015 г. Э. Т. Гайнуллина*, 1, Д. К. Туликова*, Д. О. Корнеев*, Д. В. Орешкин*,
С. Б. Рыжиков**, В. Н. Фатеенков*
*27Научный центр Министерства обороны Российской Федерации 105005 Москва, Бригадирский пер., 13 1Е-таИ: era-gaj@rambler.ru **Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, физический факультет
119992 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 2 Поступила в редакцию 10.04.2014 г., после доработки 02.08.2014 г.
Рассмотрены современные достижения в области создания технических средств мониторинга объектов окружающей среды на содержание соединений антихолинэстеразного действия. Цель данного аналитического обзора — обоснование наиболее перспективных направлений создания биосенсора на основе ингибирования холинэстеразы для мониторинга атмосферного воздуха на содержание фосфорорганических отравляющих веществ и инсектицидов, отвечающего современным требованиям по соотношению параметров чувствительность—время формирования аналитического сигнала.
Ключевые слова: биосенсор, рекомбинантные ферменты, органофосфатаза, ацетилхолинэстраза, бутирилхолинэстераза, фосфорорганические отравляющие вещества, инсектициды.
Б01: 10.7868/80044450215070051
Пункт 10 статьи IV "Конвенции о запрещении разработки, производства, накопления химического оружия и о его уничтожении" (далее — Конвенция), ратифицированной Россией 5 ноября 1997 г федеральным законом № 138-Ф3, гласит, что каждое государство — участник Конвенции в ходе транспортировки, отбора проб, хранения и уничтожения химического оружия должно уделять первостепенное внимание обеспечению безопасности людей и защите окружающей среды. Несмотря на присоединение 190 государств к Конвенции, сохраняется угроза применения токсичных химикатов, обладающих нервно-паралитическим действием, прежде всего фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) в ходе военных действий, а также в террористических актах. События в Моцумото (Япония) в 1984 г., в токийском метро в 1985 г., а также на территории нескольких сирийских городов в 2013 г. подтверждают угрозу применения ФОВ в террористических целях.
Известно, что нервно-паралитическим действием обладают и некоторые фосфорорганические инсектициды (ФОИ), широко используемые в производстве сельскохозяйственной продукции. Согласно статистическим данным, ежегодно в мире от
отравления фосфорорганическими соединениями погибает более 200000 человек [1]. В связи с этим, международным научным сообществом был признан целесообразным мониторинг объектов окружающей среды на содержание ФОИ с использованием чувствительных, простых по устройству и удобных в эксплуатации биосенсоров (БС), в том числе и в полевых условиях. На основе успехов, достигнутых в области энзимологии, биотехнологии и сенсорных технологий, только за последнее десятилетие опубликовано значительное количество статей и патентов, посвященных разработке БС для определения ФОИ, в том числе ФОВ, на основе бактериальных ферментов и холинэстераз. Повышенный интерес к разработке БС подчеркивает актуальность этих исследований, что, по-видимому, явилось основанием для проведения IV совещания Научного консультативного совета временной рабочей группы по проблемам химии и биологии с повесткой дня "Биосенсоры", проходившего в Гааге с 5 по 7 ноября 2013 г. [2]. На совещании были заслушаны доклады о конструкциях современных БС, примерах БС для определения ФОВ и ФОИ, основанных на различных принципах регистрации аналитического отклика, и обсужде-
на возможность миниатюризации БС для химической защиты. Отмечено, что использование БС для обнаружения ФОИ и ФОВ остается областью наиболее активных работ. В итогах совещания было отмечено, что наиболее интенсивные исследования ведутся по двум направлениям: 1) разработка БС на основе ацетилхолинэстеразы (АХЭ) или бутирилхолинэстеразы (БХЭ) для мониторинга объектов окружающей среды на содержание ФОВ; 2) исследования БС для диагностирования поражения ФОВ. Диагностирование с использованием БС предусматривает проведение анализа проб крови в основном после реактивации оксимами (использования антидотной терапии). По крайней мере одно из этих устройств было коммерциализировано. Было подчеркнуто, что хотя большинство технических средств (ТС) для определения боевых отравляющих веществ основано на физико-химических методах, уже более 40 лет датчики с биологическими элементами также успешно используют для определения боевых отравляющих веществ во всем мире. Широко известны индикаторные средства на основе ферментов АХЭ и БХЭ для обнаружения ФОВ. Эти ферменты используются в автоматизированных датчиках для обнаружения паров, во влажных индикаторных комплектах, билетах, индикаторных трубках и обеспечивают высокую чувствительность при обнаружении ФОВ. ТС для обнаружения паров и аэрозоля на основе различных холинэсте-раз были коммерциализированы. Однако ни один из предложенных к настоящему времени БС для мониторинга объектов окружающей среды не представляет коммерческого интереса. В итоге использование АХЭ и БХЭ для создания новых биосенсоров было признано целесообразным.
Цель обзора — анализ литературных данных для обоснования наиболее перспективных направлений создания биосенсоров на основе ингибирования хо-линэстеразы для мониторинга атмосферного воздуха на содержание фосфорорганических отравляющих веществ и инсектицидов, отвечающего современным требованиям по соотношению параметров чувствительность—время отклика.
БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ И ИНСЕКТИЦИДОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ
Бактериальные ферменты, способные специфично катализировать гидролиз ФОИ и, таким образом, детоксифицировать широкий диапазон фосфорорганических соединений нервно-пара-литичесого действия, включая ФОВ, выделены и идентифицированы еще в конце Второй Мировой Войны. Так, из образцов филиппинского риса выделен фермент фосфотриэстераза бактерии Flavobacterium [3], из бактерии почвы Pseudomonas
diminuta изолирован фермент, гидролизующий па-раоксон [3].
Ген бактерии Pseudomonas клонирован в разных модификациях, включая Escherichia coli. Полученный при этом рекомбинантный фермент фосфо-триэстераза исследовали для выяснения его способности к быстрому гидролизу ФОВ. Большую часть исследований эффективности ферментативного гидролиза ФОИ рекомбинантными бактериальными ферментами проводили с производными инсектицида параоксона, поскольку образующийся в результате ферментативного гидролиза нитрофенол относительно легко детектируется спектро-фотометрическим методом.
На основе рекомбинантных бактерий E. coli, ферменты которых гидролизуют широкий круг ФОИ, предложено биосенсорное устройство [4], в котором продукты ферментативного гидролиза ФОИ далее распадались с разрывом связей —P—O, —P—F, —P—S или —P—CN и с отщеплением двух ионов водорода. Испытания проведены на фосфор-органическом инсектициде — параоксоне.
Для регистрации аналитического сигнала при воздействии иммобилизованными клетками ре-комбинантного E. coli предложено два метода измерения концентрации аналита: реактор с перемешиванием анализируемой пробы и поток через колоночный миниреактор. В качестве физического преобразователя использовали индикаторный pH стеклянный электрод. Линейный диапазон для параоксона составлял 0.001—1.0 мМ. Времена отклика составляли ~10 мин для реактора с перемешиванием пробы и 20 мин для колоночного миниреактора. Биокатализатор можно использовать для анализа 25 проб в течение 4 ч с промывкой биокатализатора в течение 10 мин между анализами очередных проб для восстановления стартового состояния ячейки с иммобилизованными клетками рекомбинантного E. coli. Данный биокатализатор показал устойчивую способность гидролизовать па-раоксон после более чем 2 мес. хранения в 50 мМ фосфатном буфером растворе при +4°C и также обеспечивал устойчивый отклик трансдьюсера при обнаружении различных нейротоксинов.
В работе [5] описано биосенсорное устройство с бактериальным ферментом paraoxonase 1, в котором использована визуальная регистрация изменения рН в результате ферментативного гидролиза ФОИ на примере параоксона с образованием диэтилфосфата и «-нитрофенола. При этом происходит разрыв связи — P—O и освобождаются два иона водорода. Фермент paraoxonase 1 иммобилизовали с использованием глутарового альдегида на медной сетке, на которой также фиксировали чувствительный к изменению рН жидкокристаллический датчик (ЖК) на основе 4-циано-4'-пентилди-фенила и 4'-пентил-дифенил-4-карбоновой кислоты. ЖК использовали как материал трансдьюсера
для получения оптического сигнала. Близость фермента рагаохопазе 1 и ЖК обеспечивала регистрацию изменения рН с высокой чувствительностью по изменению цвета ЖК прежде, чем наступало связывание ионов водорода буферным раствором. Индикацию аналитического сигнала осуществляли визуально. После экспозиции в течение 15 мин яркость изображения ЖК-датчика в интервале концентраций параоксона 10—100 цМ сильно возрастала. Экран ЖК-датчика оставался темным, когда концентрация параоксона была ниже 1 цМ. При инкубации в течение 60 мин предел обнаружения параоксона при визуальной регистрации составлял 1 цМ [5]. Исследование бактериальных рекомбинантных ферментов продолжается для получения модифицированных ферментов, характеризующихся способностью к быстрому гидролизу ФОВ при совершенствовании мер защиты человека и окружающей среды от соединений нервно-паралитического действия, в частности, для создания эффективных де-токсифицирующих рецептур и компонентов средств химической защиты.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ МОНИТОРИНГА ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ И ИНСЕКТИЦИДОВ НА ОСНОВЕ ХОЛИНЭСТЕРАЗ
Высокая ингаляционная токсичность и кумулятивное действие ФОВ предъявляют высокие требования к ТС, предназначенным для их мониторинга в объектах окружающей среды. Так, санитарные требования к содержан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.