СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2004, том 18, № 1, с. 83-91
= БИОСЕНСОРЫ
УДК 577.3; 535.379
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ХИМИЧЕСКИ ИНИЦИИРУЕМОЙ ЭЛЕКТРОНООБМЕННОЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ КАК АНАЛОГ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ СВЕТЛЯКА
© 2004 г. Р. Ф. Васильев, А. В. Трофимов
Институт биохимической физики РАН 119991, Москва, ул. Косыгина, 4 Поступила в редакцию 23.10.03 г.
Авторами предлагается краткий аналитический обзор современного состояния исследований в области физико-химических основ функционирования хемилюминесцентных биосенсорных систем, применяемых в аналитических методиках физиологии, биофизики, молекулярной биологии и клинической биохимии. Действие рассматриваемых биосенсоров основано на явлении химически инициированной электронообменной хемилюминесценции (ХИЭОЛ), биологическим прототипом которой является биолюминесценция светляка. Основные элементы таких биосенсоров - термически устойчивые ХИЭОЛ-активные (триггерные) диоксетаны, избирательно реагирующие с определенными биомолекулами (триггерами), инициирующими хемилюминесцентный процесс.
Ключевые слова: хемилюминесцентные биосенсоры, триггерные диоксетаны, химически инициируемая электронообменная люминесценция (ХИЭОЛ).
ВВЕДЕНИЕ
Биолюминесценция светляка - восхитительное по красоте явление, описанное еще Аристотелем (Harvey, 1957), играет в живой природе роль средств световой коммуникации этих удивительных насекомых. Коммуникативная функция биолюминесценции охватывает едва ли не все стороны поведения светляков (Lloyd, 1983). В самом деле у светляков можно выделить практически все сигналы, как то территориальные, защитные, сигналы агрессии и световой мимикрии (редкое явление), сигналы видовой принадлежности и половой коммуникации - поисковые и призывные у самцов, готовности и отказа у самок и т.д. (Ланда и др., 1994; 1996). И хотя ни один из отдельно взятых видов светляков не проявляет всего спектра перечисленных биолюминесцентных сигналов, общим для всех этих насекомых является то, что с половым поведением, так или иначе, связана большая часть светового "общения" между особями. Даже феномен световой мимикрии, обнаруженный у хищных самок рода Photuris, основан на имитации сигналов половой готовности самок рода Photinus, обитающего на той же территории (Lloyd, 1965; 1983). (Самцы, Photinus, попадающиеся на такую "приманку", становятся пищей для самок Photuris.)
Параметры световых сигналов (спектральный состав, временные характеристики и интенсивность свечения) отдельных видов светляков отличны друг от друга (Lloyd, 1983). Неудивительны и различия в характеристиках зрительных си-
стем отдельно взятых видов и их способности к восприятию биолюминесцентных сигналов, в частности, их спектральной чувствительности и временном разрешении (Lall, et. al. 1982; 1988; Ланда и др., 1994). Различие спектров (т.е. цвета) биолюминесценции не в последнюю очередь определяется свойствами микроокружения эмиттера биолюминесценции, локализованного на активном центре люциферазы (Угарова, Бровко, 2001).
На клеточном уровне биолюминесценция возникает в фотоцитах, находящихся в брюшке насекомого, как было показано еще в позапрошлом веке (Овсянников, 1868; Угарова, Бровко, 1998).
То, что возникновение биолюминесценции происходит в энзиматическом процессе было предположено МакЭлроем (McElroy, 1947). Им же впервые был выделен субстрат - люциферин (Bitter, McElroy, 1957), каталитическое окисление которого приводит к генерации света, и энзим -люцифераза (Green, McElroy, 1956). Окисление люциферина кислородом воздуха, катализированное люциферазой, совершается при участии АТФ и Mg2+ и представляет собой многостадийный биохимический процесс (Владимиров, 1999; Угарова и др., 1993). В этом процессе сначала происходит обратимое связывание люциферазы с люциферином и MgАТФ, за которым следует необратимое окислением субстрата в энзим-субстратном комплексе, приводящее к образованию промежуточного замещенного диоксетанона (а-перокси-лактона). Диоксетаноны являются подклассом диоксетанов - четырехчленных кислород-углеродных циклов; последние, по образному выра-
83
6*
жению Казакова - "молекулярные световые аккумуляторы", в каждом из которых "заключен" фотон (Казаков и др., 1990). Преобразовать химическую энергию, запасенную в диоксетане (диок-сетаноне), можно, разрушив такой пероксидный цикл термически либо при помощи переноса электрона. Последний способ генерации света в химическом процессе получил название химически инициируемой электронообменной люминесценции (ХИЭОЛ) - явление, впервые обнаруженное Ку и Шустером (Koo, Schuster, 1977). Именно такой процесс скорее всего и реализуется в диоксетаноне -предшественнике эмиттера биолюминесценции светляка (Schuster, 1979), и именно на этом основан принцип дизайна современных хемилюминесцент-ных биосенсоров, который будет рассмотрен в следующем разделе.
Перед тем как перейти к описанию диоксетано-вых биосенсоров, использующих явление ХИЭОЛ, нельзя не остановиться на биосенсорных возможностях их биологического прототипа. Действительно, поскольку люминесценция люциферин-люциферазной системы невозможна без АТФ, препарат люциферина и люциферазы светляка используют в качестве биолюминесцентного сенсора для определения малых количеств АТФ. Современные биолюминесцентные методы позволяют определить вплоть до 10-18 М АТФ в пробе (Владимиров, 1999; Угарова и др., 1993). Поскольку биосинтез АТФ - показатель физиологической активности организмов, люциферин-лю-циферазные препараты находят применение для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия антибиотиков на микроорганизмы и т.д. Биоаналитические возможности люциферин-люциферазных систем не ограничиваются одним лишь определением АТФ (Владимиров, 1999), однако, серьезным
препятствием широкому использованию таких препаратов является их высокая стоимость. Последнее обстоятельство и определило необходимость создания эффективных синтетических систем, использующих те же принципы генерации света, что в процессе биолюминесценции светляка.
ДИЗАЙН ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БИОСЕНСОРОВ
КАК ДОСТИЖЕНИЕ ФОТОБИОНИКИ
Создание новых хемилюминесцентных биосенсорных систем, использующих явление химически инициируемой электронообменной люминесценции (ХИЭОЛ), можно считать одним из несомненных успехов фотобионики. Дело в том, что структуры предшественника эмиттера биолюминесценции и его синтетического аналога включают в себя сходные функциональные элементы (схема 1) - пероксидный, а именно, диоксетано-вый (в случае биолюминесценции светляка - ди-оксетаноновый) цикл и фенолят-ион. Как было упомянуто выше, диоксетановый (диоксетаноно-вый) фрагмент является источником энергии. В обоих случаях, изображенных на схеме 1, хеми-люминесцентный процесс инициируется переносом электрона (ПЭ) с фенолятного фрагмента на О-О-связь пероксида, вызывая распад этого цикла с последующим испусканием света (Adam, 1996). Чтобы предотвратить спонтанный перенос электрона с фенолят-иона, к последнему изначально присоединяется защитная группа (в простейшем случае - Н, превращая таким образом фенолят-ион в фенол). В биоаналитических целях защитную группу можно подобрать так, чтобы устранение последней было возможно лишь под действием определенного реагента - триггера (Bronstein, 1989). Такой реагент селективно убирает защитную группу, высвобождая фенолят-
Предшественник эмиттера
биолюминесценции светляка Синтетический ХИЭОЛ-активный диоксетан
O
O
\ N
CO2 ^Упэ
•о_
O-O
ПЭ v
-O_
O
*п
Эмиттер биолюминесценции светляка
O
-O ^
O_—- hv
Эмиттер ХИЭОЛ
Схема 1.
Нормированная интенсивность, отн. ед
tBu
100
Флуоресценция tßu_Oo
80 -
60 -
40
20 -
хиэол
400 440 480 520 560
X, нм
LUMO,
H3C
H3CO HOMO 0.06С 0.483
LUMO + 1
0.534 0.060 0.473 0.178 -0.467
tBu
0.058
tB
0.5
38 ^
0.46
0.538 0.053
HOMO
3u O O
MeO O
O-
Рис. 1. Нормированные спектры хемилюминесцен-ции (ХИЭОЛ) диоксетановых фенолят-ионов и флуоресценции оксибензоат-ионов.
Рис. 2. Молекулярные орбитали, участвующие в
процессе электронного (п -► п*) возбуждения
ХИЭОЛ-эмиттеров, рассчитанные АМ1-методом.
0.473
O
O
ион и запуская хемилюминесцентный процесс. Например, защитная группа PO3 устраняется щелочной фосфатазой - популярнейшим в иммунохимии реагентом (Adam, 1996). Следует заметить, что существуют и иные хемилюминесцентные методы определения щелочной фосфатазы, в том числе с использованием люциферина и люциферазы светляка (Geiger, Miska, 1987). Но очевидный недостаток таких методов это то, что ни один из них не является прямым. В то же время использование ХИ-ЭОЛ-активных диоксетанов - прямой способ определения энзиматического триггера.
Стратегия, включающая в себя подбор защитных групп, избирательно реагирующих с определенными биомолекулами, делает синтетические аналоги предшественников эмиттера биолюминесценции избирательными и эффективнейшими биосенсорами (Bronstein, Sparks, 1990); для отдельных биологически важных материалов достижим уровень определения концентраций порядка 10-21 М (Adam et al., 1996).
Понятно, что для рациональной разработки эффективных биосенсорных систем необходимо понимать основные принципы их функционирования. Ниже приводится детальный анализ состояния исследований в данной области на настоящий момент.
ПРИРОДА ЭМИТТЕРА ХИЭОЛ
Тот факт, что лишь арильный фрагмент диок-сетана является предшественником люминофора -эмиттера хемилюминесценции, подтверждается
сравнением спектров ХИЭОЛ со спектрами флуоресценции оксибензоат ионов - предполагаемых ХИЭОЛ-эмиттеров, образующихся из арильных фрагментов триггерных диоксетанов (Adam et. al., 1998). Рисунок 1 иллюстрирует сказанное -спектры флуоресценции оксибензоат-анионов, полученных как из моноциклического, так и би-циклического диоксетанов (диоксетановых фенолят-ионов), совпадают со спектрами ХИЭОЛ этих диоксетанов (Adam, Trofimov, 2002). Оба ок-сибензоат-иона, показанные на рис. 1, обладают одной и той же люминофорной группой, определяющей оптические свойства этих ионов, как видно из совпадения спектров флуоресценции. Тот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.