ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 490-496
УДК 579.69
БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ Photobacterium phosphoreum ДЛЯ БИОМОНИТОРИНГА ЭКОТОКСИКАНТОВ
© 2014 г. Е. Н. Ефременко, О. В. Сенько, Л. Э. Алескерова, К. А. Аленина,
М. М. Мажуль, А. Д. Исмаилов
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
e-mail: anvaris@list.ru Поступила в редакцию 19.02.2014 г.
Проведена иммобилизация бактерий Photobacterium phosphoreum в криогеле поливинилового спирта для создания люминесцентных биосенсоров, используемых при биомониторинге экотоксикантов. Оптимизированы процедуры иммобилизации, хранения и применения в биомониторинге иммобилизованных клеток. Показано, что иммобилизованные клетки обладают существенно большей стабильностью и длительностью свечения, чем свободные бактерии. С использованием полученных препаратов биосенсоров проведен дискретный анализ тяжелых металлов и хлорфенолов.
DOI: 10.7868/S0555109914050031
Биолюминесценция отражает реакцию клетки на химические соединения с цитотоксичным и (или) генотоксичным действием, в т.ч. тяжелые металлы, алифатические и ароматические углеводороды, фенолы и ряд других ксенобиотиков. В связи с этим в качестве биосенсоров при биомониторинге токсикантов широко используются светящиеся бактерии, поскольку эмиссионный ответ клетки служит количественным индикатором общей или специфичной токсичности образца [1—3].
В технологии биодетекции светящиеся бактерии применяются как в свободном, так и в иммобилизованном виде. Иммобилизация фотобактерий позволяет повысить стабильность биосенсора при хранении и его многократном применении [4, 5]. В качестве носителей для иммобилизации светящихся бактерий наиболее часто применяются природные (агаровые, агарозные, альгинатные) гели. При создании биолюминесцентных токсикологических биосенсоров наибольшее распространение получили Са2+ и 8г2+-альгинатные гели [4—7]. Иммобилизованные в таких гелях бактерии РНо1оЬас1егшт ркозрИогвит нашли свое применение в технологии непрерывного мониторинга токсикантов [5].
Наряду с природными гель-формирующими агентами, для иммобилизации самых разных групп микроорганизмов эффективно используются криогели поливинилового спирта (ПВС) [8]. В работах [9, 10] приведены результаты сравнительного тестирования различных носителей, в том числе гелей ПВС, для иммобилизации светящихся бак-
терий P. phosphoreum. Длительность свечения фотобактерий, иммобилизованных в гели ПВС, при 4°С не превышала 7 сут [9, 10]. Технология иммобилизации в геле ПВС клеток Vibrio fischeri и генно-инженерного штамма Pseudomonas putida со встроенным lux-опероном из Photorabdus luminescence была успешно реализована для биодетекции фенольных токсинов в индустриальных отходах [11]. На основании имеющихся данных [12], можно полагать, что интенсивность и стабильность эмиссии иммобилизованных препаратов, определяется не только технологией иммобилизации, но и люминесцентными характеристиками выбранного штамма фотобактерий. Так, психрофильные штаммы P. phosphoreum обладают наиболее интенсивной и длительной люминесцентной активностью в глубинной культуре [13, 14].
Цель работы — получение люминесцентных биосенсоров на основе светящихся бактерий Р. phosphoreum шт. 331 , иммобилизованных в криогеле ПВС, установление основных факторов стабилизации свечения клеток в носителе и использование полученных препаратов при биомониторинге токсикантов.
МЕТОДИКА
Бактериальный штамм и условия выращивания.
В работе использован выделенный из вод Белого моря психрофильный штамм светящихся бактерий P. phosphoreum (шт. 331 коллекции микроорганизмов МГУ). Характеристики штамма были описаны в работе [14].
Влияние состава среды, использованной при формировании криогелей ПВС, и среды инкубации иммобилизованных клеток фотобактерий на уровень их люминесценции
№ Среда для формирования криогеля ПВС Среда инкубации гранул с иммобилизованными клетками Начальная интенсивность свечения, мВ/гранула Длительность свечения, сут
1 СК СК 500—1000 42
0.1 М ^-фосфатный буфер с 2% №С1 500—900 41
2 СК без пептона СК без пептона 10—20 12
0.1 М ^-фосфатный буфер с 2% №С1 9—20 11
3 3%-ный №С1 3%-ный №С1 0.5—1.0 5
0.1 М ^-фосфатный буфер с 2% №С1 0.5—1.0 5
Бактерии выращивали в течение 22 ч (поздняя логарифмическая фаза роста) при 20° С в глубинной культуре на комплексной среде, рН 7.5, среда культивирования (СК) следующего состава (г/л дистиллированной воды): №С1 — 30.0, №2НР04 — 5.3, КН2Р04 ■ 2Н20 - 2.1, (МН4)2НР04 - 0.5, МЕВО+х ■ • 7Н20 — 0.1, дрожжевой экстракт — 1.0, пептон — 5.0, глицерин — 3.0.
Получение биомассы. Клетки осаждали центрифугированием (3000 §, 20 мин), отмывали однократно 0.1 М ^-фосфатным буфером, рН 7.6, содержащим 2% №С1, и повторно центрифугировали в тех же условиях. Осадок сырой биомассы, плотностью 2—5 х 109 кл./мл использовали для иммобилизации.
Иммобилизация клеток. Раствор ПВС (молекулярной массы 48000 Да) готовили на основе полусинтетической среды ^Ю, СК без пептона и 3%-ного МС1. Клетки суспендировали в 10%-ном растворе ПВС до получения однородной массы. Концентрация клеток в общей массе полученной смеси составляла 1%. Смесь разливали по 200 мкл в ячейки 96-луночного планшета, замораживали при —20 или —80°С и инкубировали в течение 17 ч для образования криогеля, содержащего клетки в формирующейся полимерной матрице. Состав полученного препарата (мас. %): биомасса бактерий — 1; поливиниловый спирт — 9.9; водная фаза — до 100. Размораживание планшетов с гранулами проводили при 4°С в течение 17 ч. Гранулы хранили при 7°С в 0.1 М Ма-фосфатном буфере, рН 7.6, содержащем 2% №С1.
Концентрацию клеток в растущей культуре или суспензии определяли спектрофотометрически по величине оптической плотности при 660 нм (А660пт), а в гранулах — по содержанию АТФ био-
люминесцентным методом с использованием лю-циферазы светляков [16].
Определение люминесцентной активности. Для
анализа биолюминесцентной активности клеток суспензию разводили в 103—105 раз в 3%-ном №С1. Максимальный уровень свечения определяли в течение 10 сек при 22° С. Активность иммобилизованных клеток рассчитывали по максимуму свечения одной гранулы в 1 мл 3%-ного №С1 после выравнивания температуры гранул и раствора (22° С) и относили к количеству клеток в грануле. Люминесцентную активность определяли на люминометре 1250 LKB-Wa11ac (Щвеция) и выражали в мВ. Измерения проводили в термо-статируемой кювете термодатчиком в пробе с бактериями.
Определение токсикантов. 10 мкл токсиканта различных концентраций (10—1—10—8 М в воде или этаноле) вносили в 1 мл среды инкубации (2%-ного №С1), содержащей 1 гранулу (150 мг) с иммобилизованными клетками. В контроль вносили соответствующий объем растворителя. Все эксперименты проводили в трех повторах, при 22°С. Процедура анализа включала уравновешивание гранул с температурой среды (22°С) в течение 10 мин, и последующую инкубацию гранул с токсикантом в течение 5 мин. В контроль вносили соответствующие аликвоты растворителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Иммобилизация фотобактерий в криогеле ПВС.
Можно было предположить, что среда формирования криогелей ПВС влияет на стабильность и метаболическую активность клеток в носителе и, прежде всего, на стадии криогенного гелеобразования. Проведен анализ эмиссионной активности и кине-
% 100
10
0.1
% 100
(а)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Рис. 1. Кинетика изменения интенсивности свечения иммобилизованных (1) и свободных (2) клеток P. phosphoreum в СК при 7°C.
тики затухания свечения клеток бактерий P. phosphoreum, иммобилизованных при —20°С, после процедуры "замораживание/оттаивание" в трех криогель-формирующих средах: СК, СК без пептона и 3%-ный NaCl.
Результаты анализа интенсивности свечения гранул (таблица) после размораживания до 4° С и стабилизации свечения клеток при 22°С показали, что наиболее эффективной средой для формирования криогелей ПВС является среда, используемая для культивирования бактерий. В данной среде после размораживания бактерии сохраняли практически 100%-ный уровень люминесцентной активности. Отсутствие пептона в среде формирования криогеля ПВС приводило к снижению начальной эмиссионной активности гранул в 20—100 раз. Снижение начального уровня свечения в 103—104 раз наблюдалось при иммобилизации клеток в криогелях ПВС, сформированных в 3%-ном NaCl. Таким образом, состав среды формирования криогелей ПВС оказывал существенное влияние на интенсивность и длительность эмиссии иммобилизованных клеток.
На рис. 1 приведена кинетика изменения интенсивности свечения свободных и иммобилизованных клеток P. phosphoreum в СК при 7°C. Полную потерю свечения свободными клетками в этих условиях наблюдали через 10 сут, в то время как детектируемый уровень свечения иммобилизованных клеток сохранялся на протяжении 1.5 мес.
Таким образом, в отличие от свободных иммобилизованные в криогеле ПВС клетки характеризовались более пролонгированной люминесцентной активностью.
%
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
20 °C
(б)
pH
Рис. 2. Зависимость интенсивности свечения иммобилизованных (1) и свободных (2) клеток P. phosphoreum от температуры (а) и от рН (б).
При —80°С 100%-ный уровень люминесцентной активности гранул с иммобилизованными клетками, сформированными в полной СК, сохранялся в течение 1 г. Снижение свечения гранул, хранившихся при —20°С, за тот же период достигал 70%. Таким образом, гранулы с иммобилизованными клетками фотобактерий длительно сохраняли стабильность при хранении в условиях отрицательных температур.
Зависимость свечения иммобилизованных клеток бактерий P. phosphoreum от температуры и рН.
Сравнительный анализ зависимости интенсивности люминесценции свободных и иммобилизованных клеток от температуры представлен на рис. 2а. Зависимость интенсивности биолюминесценции иммобилизованных клеток от темпе-
1
2
ч
0
м
Рис. 3. Тушение свечения иммобилизованных клеток Р. phosphoreum тяжелыми металлами: 1 — Си804, 2 — ЩС12, 3 — СоС12, 4 — ZnCl2 (растворы в воде); свечение контрол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.