научная статья по теме БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ ДНК Химия

Текст научной статьи на тему «БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ ДНК»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 45, № 2, с. 252-256

УДК 544.653.2:577.323.7

БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДНЫХ НАНОТРУБОК ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРЫ ДНК

© 2009 г. Т. И. Абдуллин*, О. В. Бондарь*, А. А. Ризванов**, И. И. Никитина*

*Казанский государственный университет, Казань, 420008 **Казанский государственный медицинский университет, Казань, 420012

e-mail: tabdulli@gmail.com Поступила в редакцию 30.01.2008 г.

Выяснены особенности определения ДНК с использованием электродов, модифицированных углеродными нанотрубками (УНТ). УНТ облегчают электрохимическое окисление гуанинового нуклео-тида ДНК, что позволяет напрямую определять ДНК на модифицированном электроде. Электрохимические свойства ДНК зависят от ее вторичной структуры и молекулярной массы. Денатурация на-тивной ДНК улучшает адсорбцию биополимера на УНТ, что приводит к увеличению тока окисления ДНК на модифицированном электроде. Сходный эффект наблюдается после обработки ДНК ультразвуком или реактивом Фентона вследствие фрагментации биополимера. Результаты показывают возможность создания биосенсоров на основе электродов, модифицированных УНТ, для прямого определения ДНК, характеристики ее структуры и выявления ДНК-повреждающих факторов.

Создание экспрессных и надежных методов определения нуклеиновых кислот (НК) является актуальной задачей современной биологии и медицины. Для ее решения перспективно использовать электрохимические биосенсоры, которые характеризуются высокой чувствительностью, низкой требовательностью к условиям анализа, возможностью уменьшения размера [1, 2]. На базе электрохимических биосенсоров разрабатывают новые методы определения НК, в которых для генерирования сигнала применяют низкомолекулярные индикаторы, селективно взаимодействующие с НК, или различные метки, ковалент-но связанные с олигонуклеотидным зондом. Эти методы служат основой создания коммерческих биочипов для выявления специфических последовательностей в ДНК [2].

Известно, что НК обладают собственной электрохимической активностью, обусловленной способностью нуклеотидов восстанавливаться или окисляться под действием приложенного к электроду потенциала. Это свойство применимо в биосенсорах, так как может быть использовано для прямого и селективного определения НК и выявления генотоксических веществ [2, 3]. Сигналом в таких биосенсорах обычно служит ток окисления пуринов, как наиболее легко обнаруживаемых компонентов НК.

Сокращения. дДНК - денатурированная ДНК, нДНК - натив-ная ДНК, НК - нуклеиновая кислота, СУЭ - стеклоуглерод-ный электрод, СУЭ-УНТ - стеклоуглеродный электрод, модифицированный углеродными нанотрубками, УНТ - углеродные нанотрубки.

Вследствие особенностей электрохимического окисления нуклеотидов чувствительность прямого определения НК на обычных электродах относительно низка [4]. Использование соединений и материалов, облегчающих протекание электрохимических реакций с участием НК, позволяет преодолеть эту проблему. Углеродные нанотрубки (УНТ) являются одним из таких материалов, особенно востребованным в биосенсорах благодаря высокоорганизованной наноструктуре, химической устойчивости и совместимости с биомолекулами [5]. Исследования последних лет показывают, что УНТ проявляют каталитическое действие при электрохимическом окислении НК и их компонентов, существенно увеличивая сигнал [5-7]. Это свидетельствует о перспективности применения электродов из УНТ в биосенсорах, основанных на электроактивных свойствах НК. Ключевым этапом разработки таких биосенсоров является выяснение особенностей адсорбции и окисления НК на электродах из УНТ.

Цель работы - изучение поведения ДНК на разработанных ранее электродах на основе многостенных УНТ [8, 9]; рассмотрение схемы, объясняющей особенности электрохимических реакций полинуклеотидов.

МЕТОДИКА

Реактивы. Высокомолекулярная ДНК из эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия); многостенные углеродные нанотрубки (УНТ) диаметром 3-10 нм и длиной 0.1-10 мкм ("Sigma- Aldrich", США); агаро-за, ЭДТА ("Serva", Германия); трис(гидроксиме-

0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

В

Рис. 1. Вольтамперограмма окисления термически денатурированной ДНК, адсорбированной на СУЭ-УНТ из 0.8 мг/мл раствора. 1 - пик, соответствующий примеси свободного гуанина; 2 - пик гуанинового нук-леотида (ДНК). Пунктирная линия - фоновая кривая. Скорость сканирования потенциала 0.1 В/с, натрий-ацетатный буферный раствор, рН 5.0.

тил)аминометан ("Хеликон", Россия); этидия бромид ("Koch-Light", Англия); формалин, минеральные кислоты и соли ("Экрос", Россия).

Приготовление образцов ДНК. Концентрацию и степень депротеинизации ДНК, растворенной в 0.01 М цитратном буфере, содержащем 0.1 М NaCl (рН 7.0), оценивали спектрофотомет-рически [10]. В раствор ДНК (0.8 мг/мл) добавляли нейтрализованный формалин, содержащий 1 мМ ЭДТА, до концентрации 1%. ДНК денатурировали в присутствии формалина и без формалина, прогревая раствор при 100°С с последующим быстрым охлаждением. Эта процедура приводит к увеличению поглощения ДНК при 260 нм (гиперхромный эффект), которое при добавлении формалина составило около 38%. Для фрагментации ДНК раствор многократно пропускали через шприц с тонкой иглой (пипетировали) или обрабатывали ультразвуком на диспергаторе УЗДН-А ("Селми", Украина). Электрофоретическое разделение образцов ДНК осуществляли в 0.7%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8.2 [10]; в лунку вносили около 0.5 мкг ДНК.

Электрохимический анализ. Дисковые стекло-углеродные электроды (СУЭ) диаметром 1.5 мм модифицировали посредством формирования на рабочей поверхности слоя УНТ, предварительно окисленных в смеси азотной и серной кислот [8, 9]. Трехэлектродная ячейка состояла из чистого или модифицированного СУЭ (рабочий электрод), хло-ридсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl) и никелевой пластины (противоэлектрод). Измерения проводили с использованием вольтамперомет-рического анализатора Экотест-ВА ("Эконикс-Эксперт", Россия) в 0.01 М буферных растворах, содержащих 0.1 M NaCl в качестве поддерживающего электролита. Разработанный метод определения ДНК [8, 11] основан на предварительной ад-

сорбции биополимера на модифицированном электроде и регистрации тока окисления (сигнала) адсорбированной ДНК в режиме линейного сканирования потенциала (в отсутствие ДНК в электролите). Для изготовления биосенсора применяли другой способ иммобилизации ДНК, при котором аликвоту раствора ДНК наносили на поверхность модифицированного электрода и высушивали в воздушном потоке. Гидроксил-радикал генерировали по реакции Фентона [12] при комнатной температуре в 0.01 М NaH2PO4 (рН 6.5), содержащем Fe2+, ЭДТА и пероксид водорода до конечных концентраций 0.025 , 0.05 и 0.15 мМ соответственно. После 10 мин инкубации биосенсора в предварительно выдержанном реактиве Фентона регистрировали вольтамперограммы ДНК. Контрольными растворами служили реактивы без добавления ионов железа или пероксида водорода. Различия в регистрируемом сигнале были статистически достоверны (р < 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Входящие в состав НК нуклеотиды окисляются на электроде при высоких потенциалах, увеличивающихся от + 1 до + 1.5 В относительно Ag/AgQ в ряду ГМФ, АМФ, ТМФ, ЦМФ. При этих потенциалах окисляются ионы электролита, что приводит к повышению фонового тока электрода и, как следствие, затрудняет определение нуклеотидов [13]. На модифицированном углеродными нанотрубка-ми электроде (СУЭ-УНТ) единственным обнаруживаемым нуклеотидом ДНК является дГМФ, окисляющийся с меньшим перенапряжением [8]. На анодной вольтамперограмме ДНК на СУЭ-УНТ появляется пик, соответствующий этому нук-леотиду, с максимумом около +1.1 В (рис. 1).

Наблюдаемое поведение ДНК на СУЭ-УНТ свидетельствует о существенном облегчении электрохимического окисления ДНК в присутствии УНТ, так как на обычных электродах, в том числе на немодифицированном СУЭ, ДНК не проявляет подобной электроактивности. Этот эффект можно объяснить способностью УНТ формировать на электроде наноструктурированное покрытие, которое, с одной стороны, увеличивает число центров адсорбции ДНК, а с другой - содержит поверхностные кислородсодержащие группы, катализирующие электрохимическую реакцию [8, 9]. Величина тока окисления гуанинового нуклеотида пропорциональна количеству ДНК, адсорбированного на СУЭ-УНТ, которое, в свою очередь, зависит от концентрации ДНК в растворе [11]. Это служит основой прямого определения ДНК с использованием СУЭ-УНТ.

Следует отметить, что растворы ДНК, как правило, содержат высвобождаемые при депуринизации гуанин и аденин, которые окисляются на СУЭ-УНТ при более низких потенциалах, чем соответствую-

254

АБДУЛЛИН и др.

мкА 6

4

2

1

2

3

Рис. 2. Влияние денатурации ДНК на величину тока (I, мкА) ее окисления на СУЭ-УНТ. 1 - нативная ДНК, 2 - термически денатурированная ДНК, 3 - нативная ДНК + 1%-ный формалин, 4 - ДНК после термической денатурации с 1%-ным формалином.

мкА 12 г

II

I*

б

гЪ

1

2

3

Рис. 3. Влияние механической фрагментации натив-ной ДНК (I) и денатурированной ДНК (II) на генерируемый сигнал на СУЭ-УНТ. 1 - контроль, 2 - пипе-тирование, 3 - обработка ультразвуком.

Рис. 4. Электрофореграмма образцов ДНК, подвергнутых механической фрагментации. 1 - ДНК-маркеры (23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027 п.н.), 2 - нативная ДНК, 3 - нативная ДНК после пипетирования,

4 - нативная ДНК после обработки ультразвуком,

5 - денатурированная ДНК, 6 - денатурированная ДНК после пипетирования, 7 - денатурированная ДНК после обработки ультразвуком.

щие им нуклеотиды. Окисление гуанина на СУЭ-УНТ не подвержено мешающему влиянию компонентов ДНК, что позволило разработать экспрессный способ выявления депуринизации ДНК с помощью СУЭ-УНТ, который основан на определении свободного гуанина в растворе ДНК [11]. Аденин окисляется при близких потенциалах с дГМФ, поэтому присутствие аденина в образце ДНК будет приводить к завышению концентрации определяемой на электроде ДНК. Существенно уменьшить скорость депуринизации и, в результате, влияние аденина на обнаружение ДНК на СУЭ-УНТ можно, используя для ДНК слабощелочные буферные

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком