ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 2, с. 187-190
УДК 579.264:628.54
БИОСИНТЕЗ БИОПРОТЕКТОРА ЭКТОИНА АЭРОБНЫМИ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ ИЗ МЕТАНОЛА
© 2010 г. Н. В. Доронина, В. А. Ежов, А. П. Бесчастный, Ю. А. Троценко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290
e-mail: trotsenko@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 04.03.2009 г.
Впервые показано, что нейтрофильные метилобактерии Methylophaga thalassica и M. marina имеют более высокие скорости роста и уровни накопления эктоина по сравнению с галоалкалофильными видами M. alcalica, M. natronica, а также метанотрофами Methylomicrobium alcaliphilum и M. kenyense. Оптимизированы условия культивирования M. thalassica на среде с метанолом. Достигнуты показатели процесса: абсолютно сухая биомасса — 60 г/л с содержанием эктоина 15—19% (9—11 г/л). Разработана схема экстракционного выделения и очистки эктоина из биомассы, позволяющая получать препараты разной степени чистоты.
Циклическая иминокислота эктоин (1,4,5,6-тет-рагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат) -универсальный биопротектор белков, нуклеиновых кислот и целых клеток. Мультифункциональные защитные свойства эктоина, первоначально описанные для микроорганизмов и макромолекул, подтверждены на разнообразных объектах. Показана перспективность использования этого биопротектора в медицине, косметике, научной практике и смежных областях [1—5]. Наряду с другими низкомолекулярными шаперонинами (бетаины, трегало-за, цитруллин), эктоин ингибирует in vitro образование амилоидных бляшек, уменьшает токсическое действие на клетки нейробластомы, является потенциальным лекарством в терапии диабета и болезни Альцгеймера [6]. Эктоин может быть использован при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата (удерживает воду, стимулирует образование синовиальной жидкости в толще хряща). Эктоин все более активно используется в косметологии, т.к. легко проникает в клетки, повышая их тургор, характеризуется отсутствием токсичности и иммуно-генности, защищает кожу человека от высушивания при перепадах температур, воздействии ветра, частых умываниях. Местное применение эктоина предотвращает преждевременное старение кожи. Эктоин защищает клетки эпидермиса от ультрафиолета, способен нейтрализовать синглетный кислород, что позволяет существенно снизить окислительное повреждение кожи [4]. Показана способность эктоина препятствовать потере воды, вызываемой ПАВ, при этом эктоин является гораздо более эффективным увлажнителем, чем глицерин [7]. Эктоин используется как криопротектор при консервации яйцеклеток, сперматозоидов, тканей и целых органов. Введение эктоина в качестве пищевой добавки в корм животным существенно повышает их устойчивость к заболеваниям и при-
рост биомассы. Следовательно, поиск новых продуцентов этого ценного метаболита весьма актуален.
Определенный интерес для производства эктоина представляет метан — наиболее распространенный на Земле возобновляемый органический газ, который используется аэробными метанотрофны-ми бактериями в качестве источника углерода и энергии. Однако культивирование бактерий на метане сопряжено с рядом трудностей и, прежде всего, с взрывоопасностью смеси метана и кислорода (воздуха). Кроме того, метанотрофы образуют при росте на метане сложную систему внутрицитоплаз-матических мембран (ВЦМ), а галофильные культуры также поверхностные слои ^-слои), что снижает эффективность превращения метана в целевой продукт [1]. 8-слои — регулярные паракристалличе-ские гликопротеиновые структуры, покрывающие всю поверхность клеток, нековалентно связаны с липополисахаридами, тейхоевыми кислотами, пеп-тидогликанами и другими интегральными компонентами оболочки прокариот. Более перспективен для получения эктоина метанол — сравнительно дешевый непищевой субстрат, используемый как метанотрофами, так и метилобактериями.
Цель работы — отбор активного бактериального продуцента эктоина, оптимизация условий его культивирования на среде с метанолом и разработка экстракционного метода выделения целевого продукта из биомассы.
МЕТОДИКА
Объекты и условия культивирования. Галоалкало-толерантные метанотрофы МвЖуЬтюгоЬшт а1-ааИрНИит 202 (ВКМ В-2133) и М. квпувтв АМО1 (ВКМ В-2464) выращивали на минеральной среде следующего состава (г/л): №2НР04 • 12Н20— 0.3, КН2Р04—0.14, КМ03-1.0, Ы§804 • 7Н20-0.2, СаС12 • 2Н20—0.02, ЭДТА№2-0.005, Бе804 • 7Н20-
188
ДОРОНИНА и др.
0.02, NaHCO3—8.4, Na2CO3-10.6; микроэлементы (мкг/л): ZnSO4 • 7H2O—100, MnCl2 • 4Н20-30, CuCl2 • 5H2O—10, CoCl2 • 6H2O—200, NiCl2 • 6H2O-20, Na2MoO4—30, H3BO3—30, вода дистиллированная, pH среды 9.5—9.8. Растворы фосфатов, карбонатов и микроэлементов стерилизовали отдельно и вносили непосредственно перед посевом. Соленость среды устанавливали добавлением NaCl в различных концентрациях (0—150 г/л).
Галоалкалофильные метилобактерии Methylo-phaga alcalica М8(ВКМ В-2251) и M. natronica Bur 2 (ВКМ В-2288) выращивали на минеральной среде, содержащей (г/л): KNO3-1.0, KH2PO4-1.0, MgSO4
• 7H2O—0.22, NaCl от 0 до 150 и 10мл/л раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов содержал (г/л): CoCl2 • H2O-0.5, CaCl2 • 6H2O-0.5, MnSO4 • H2O—0.2, ZnSO4 • 7H2O—0.5, Na2MoO4 •
• 2H2O—0.02, CuSO4 • 5H2O—0.1, FeSO4 • 7H2O-1.0.
Различные значения pH (7.0—12.0) устанавливали добавлением растворов 2 М NaHCO3 и 1 М Na2CO3 к 100 мл среды (конечная концентрация обоих компонентов не превышала 0.11 М).
Нейтрофильные галофильные метилобактерии Methylophaga marina MM (ВКМ В-2056) и M. thalas-sica МТ (ВКМ В-2057) выращивали на среде, содержащей (г/л): KH2PO4—2.0, (NH4)2SO4-2.0, MgSO4 •
• 7H2O—0.125, FeSO4 • 7H2O-0.002, NaCl от 0 до 150, 20 мкг витамина В12; 10 мл/л раствора микроэлементов, pH среды 7.0—7.2. Метилотрофов выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды и 0.1 мл CH3OH, с дробным добавлением через 6 ч по 0.1 мл CH3OH при 29°С на качалке (180 об/мин). Культивировали в течение 24 ч.
У культур, выращенных при оптимальных значениях pH и 5% NaCl (вес/об.), анализировали в пересчете на абсолютно сухую биомассу (АСБ) содержание эктоина, глутамата, сахарозы и экзополиса-харида (ЭПС).
Содержание эктоина, глутамата и сахарозы в биомассе оценивали методом протонного резонанса на ЯМР-спектрометре высокого разрешения WP 80 SY ("Bruker", Германия) [8]. Кроме того, количественный анализ эктоина в биомассе проводили методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ("LKB", Швеция) с УФ-детектором Uvis 200 ("Linear", США) при 230 нм [9]. ЭПС анализировали в супер-натанте культуральной жидкости по содержанию редуцирующих сахаров [10].
На ультратонких срезах клеток определяли наличие S-слоев и ВЦМ ранее описанными методами [11].
Периодическое культивирование отобранного продуцента проводили в ферментере АНКУМ-2М ("Биоприбор", Россия) с автоматическим поддержанием температуры 29°С, рО2 20—30%, pH 7.2 ( добавлением растворов 25%-ного NH4OH или 10%-ного NaOH) на оптимизированной минеральной среде (г/л): KH2PO4-1.0, Na2HPO4 • 12H2O-1.0, (NH4)2SO4-1.0, MgSO4 • 7H2O—0.1, NaCl—90, ви-
тамин В12—10 мкг/л и 20 мл/л раствора микроэлементов.
При достижении культурой оптической плотности (ОП) 10, добавляли 50 мл концентрата среды (г/л): H3PO4—270, MgSO4 • 7Н20-80, FeSO4 • 7H2O-2.3, CaCl2 • H2O-0.6, MnSO4 • H2O-0.3, CoCl2 • 6H2O-0.5, ZnSO4 • 7H2O—0.6, CuSO4 • 5H2O-0.4. Метанол добавляли дробно по мере потребления культурой, о чем судили по резкому увеличению концентрации растворимого кислорода (pO2). Содержание биомассы определяли, измеряя ОП на спектрофотометре (Specord UV VIS "Carl Zeiss", Германия) при 570 нм в кювете 0.5 см и пересчитывая на АСБ по предварительно построенной калибровочной кривой. Содержание N H+ в культуральной среде анализировали на иономере МА-130 ("Mettler—Toledo GmbH", Швейцария) с аммонийным датчиком.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel и System Sigma Plot 10.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Потенциально перспективными продуцентами эктоина представлялись галоалкалофильные мети-лотрофы, поскольку культивирование при pH 9.0— 9.5 можно вести в полустерильных условиях. Однако оказалось, что нейтрофильные галофильные ме-тилобактерии имеют более высокую удельную скорость роста, синтезируют больше эктоина и меньше ЭПС, т.е. более эффективно используют метанол, чем алкалофилы (таблица). У всех исследованных штаммов алкалофилов наблюдали интенсивное "холостое" окисление метанола, а метанотрофы образовывали редуцированные ВЦМ и S-слои. Следовательно, алкалофильные метилобактерии и метанотрофы менее эффективно превращают метанол в эктоин.
На основании проведенных сравнительных исследований для дальнейшей работы нами была выбрана нейтрофильная культура M. thalassica МТ, обладающая наибольшей скоростью роста, высоким уровнем накопления эктоина и более эффективной конверсией углерода метанола в биопротектор.
Опыты по культивированию M. thalassica МТ в колбах показали, что с увеличением концентрации NaCl в среде содержание эктоина в биомассе возрастало (рис. 1). Выявлено, что рост культуры, оптимальный при 30—60 г/л NaCl, при дальнейшем увеличении концентрации NaCl угнетался. Оптимальным для биосинтеза эктоина является содержание NaCl 90 г/л. Наиболее эффективным источником азота оказался (NH4)2SO4, при использовании которого прирост биомассы и содержание эктоина было выше, чем при эквивалентном по азоту содержании NaNO3 или NH4NO3. Оптимальная концентрация (NH4)2SO4 в среде составила 1—2 г/л. Увеличение концентрации ионов аммония в среде приводило к частичному выходу эктоина из клеток
БИОСИНТЕЗ БИОПРОТЕКТОРА ЭКТОИНА 189
Параметры культивирования галофильных метанотрофов и метилобактерий
Штамм-продуцент №С1, % рН Удельная скорость роста, ц, ч-1 Содержание, г/100 г АСБ (при 5% №С1) Наличие
диапазон оптимум диапазон оптимум экто-ин глута-мат сахароза ЭПС ВЦМ Б-слои
Мв1ку1о- акаИрЫЫт 202 0-10 1-3 7.2-10 9.5 0.1 9.0 4.0 2.5 9.8 + +
ткгоЫыт кепуепзе АМО1 0-5 0-2 9.0-10.2 9.0-10 0.05 5.0 2.5 5.0 9.4 + +
МггкуЬ- ак
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.