УДК 582.28:579.222.3.083.1
БИОСИНТЕЗ ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ Yarrowia lipolytica
И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ
© 2015 г. С. В. Камзолова*, Ю. Н. Лунина*, Р. К. Аллаяров***, И. Ф. Пунтус*, И.А. Лаптев***, В. А. Самойленко*, И. Г. Моргунов***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: morgunovs@rambler.ru **Пущинский государственный естественнонаучный институт, Пущино Московской обл., 142290 ***Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,
Москва, 117545 Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Изучен биосинтез изолимонной кислоты из рапсового масла дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция. Установлена принципиальная возможность направленного биосинтеза дрожжами Y. lipolytica изолимонной кислоты с минимальным содержанием побочного продукта — лимонной кислоты на среде, содержащей рапсовое масло. В результате УФ-облучения и обработки N-метил-М'-нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) природных штаммов Y. lipolytica и последующей селекции на средах с ацетатом и изоцитратом получен мутант Y. lipolytica УФ/НГ, который синтезировал изоцитрат и цитрат в соотношении 2.7 : 1, в отличие от исходного штамма, у которого это соотношение — 1 : 1. Показано, что ингибирование изоцитрат-лиазы — ключевого фермента метаболизма изолимонной кислоты, итаконо-вой кислотой приводило к увеличению синтеза изоцитрата до соотношения изоцитрат : цитрат 6 : 1. При выращивании мутанта Y. lipolytica УФ/НГ в полупромышленном ферментере в присутствии итаконовой кислоты синтезировалось 88.7 г/л изолимонной кислоты с выходом 90%.
Ключевые слова: дрожжи Yarrowia lipolytica, трео-Б8-изолимонная кислота, рапсовое масло, мутагенез, изоцитрат-лиаза, итаконовая кислота.
DOI: 10.7868/S0555109915020075
Органические кислоты представляют собой важную группу продуктов, которые могут быть получены биотехнологическим путем [1—6]. В ряде стран лимонную, уксусную, глюконовую, молочную и итаконовую кислоты получают микробным синтезом в промышленных количествах. В настоящее время становится перспективной разработка методов получения изолимонной кислоты (ИЛК), которая может найти применение в пищевом производстве, медицине, сельском хозяйстве, а также в качестве реактива для биохимических исследований [1, 4]. ИЛК обладает гепато-защитным и антигипоксическим действием и может использоваться в качестве актопротекторного средства в спорте высоких достижений. В связи с этим исключительную важность приобретает поиск источника ее получения.
ИЛК имеет четыре изомера: эритро-Э8-, эритро-Ь8-, трео-Ь8- и трео-Э8- [7]. Из них только трео-Э8-изолимонная кислота является природным соединением, которое присутствует в каждой живой клетке. Именно этот изомер представляет практический интерес, так как остальные три изомера не метаболизируются клетками и даже ингибируют ряд ферментных систем. Трео-Э8-
ИЛК может накапливаться в больших количествах в листьях и стеблях некоторых растений, фруктах и ягодах, особенно много ее в ежевике. С 1980 г. компания "81§та-АЫг1сИ" (США) производит монокалиевую соль ИЛК из сока цветущего очитка видного (Бейиш зре^аЬйе или ИуШе1ерЫиш зре&-аЬйе), которую продает по цене 551 € за 1 г.
В настоящее время показано, что условием сверхсинтеза ИЛК дрожжами Уаггота Иро1уИса является лимитирование их роста минеральными компонентами среды — азотом, фосфором, серой или магнием, при одновременном избытке источника углерода и тиамина [8—10]. Перспективным субстратом для получения ряда веществ с помощью микроорганизмов являются растительные масла [2, 4]. Использование растительных масел в качестве субстрата обеспечивает образование продукта, который может применяться в пищевой и медицинской промышленности. Ранее было показано, что при выращивании природных штаммов дрожжей Т. Иро1уИса в среде с растительными маслами (рапсовое, подсолнечное, оливковое и др.) образуются примерно равные количества ИЛК и лимонной кислоты (ЛК) [11—19], что существенно
Таблица 1. Состав сред для скрининга мутантов—продуцентов ИЛК
Компонент питательной среды Селективная среда
А Б В г Д
Рапсовое масло, г/л 10.0 - - - 20.0
Ацетат натрия, г/л - 7.0 - - -
Изоцитрат натрия , г/л - - 7.0 - -
Агар-агар, г/л 20.0 20.0 20.0 20.0
Дрожжевой автолизат, мл/л - - - 8.0 -
Дрожжевой экстракт "ОИЬо", мл/л 0.5 0.5 0.5 - 0.5
(N44^04, г/л 3.0 3.0 3.0 - 0.3
МgS04 • 7Н20, г/л 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
№С1, г/л 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Са^ОзЬ, г/л 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
КН2Р04, г/л 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
К2НР04, г/л 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Микроэлементы, мл/л 5.0 5.0 5.0 5.0 10.0
СаС03, г/л - - - 6.0 -
снижало выход целевого продукта и затрудняло выделение и очистку ИЛК.
Цель работы — исследование направленного синтеза ИЛК дрожжами У. Иро1уИса с минимальным содержанием ЛК на среде с рапсовым маслом.
МЕТОДИКА
Исходными культурами для получения мутантов-продуцентов ИЛК были природные штаммы У. Иро1уИса 607, У. Иро1уИса 672 и У. Иро1уИса 704, полученные из коллекции лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина. Культуры поддерживали на агаризованной среде Ридера с парафином при температуре 4°С.
Мутанты получали облучением суспензии клеток У. Иро1уИса плотностью 6—8 х 107 кл./мл с расстояния 10 см в течение 1—7 мин (источник УФ-облучения — бактерицидная лампа ВИО-2 ("Фимет", Россия) с длиной волны 200—400 нм), а также обработкой суспензии клеток в 0.1 М цит-ратном буфере, рН 6.0, ^метил-№-нитро^-нит-розогуанидином (НГ, 30—100 мкг/мл). Была использована также комбинированная обработка УФ-лучами (4—5 мин) и НГ (50 мкг/мл). Обработанную и контрольную суспензии клеток после разведения высевали на чашки с агаризованной средой Ридер и инкубировали в термостате при
28—29°С в течение 48 ч. На чашках определяли количество выросших колоний. По графику зависимости выживаемости клеток от времени облучения рассчитывали процент выживших клеток. Для дальнейшего анализа использовали суспензии клеток, у которых процент выживаемости составлял менее 1% после обработки УФ-лучами и 25% — НГ. Отбирали колонии с меньшими по сравнению с исходными размерами и измененными морфологическими признаками. Для выявления негативных колоний клетки высевали на агаризованную среду Ридер, содержащую рапсовое масло (среда А), и на ту же агаризованную среду, но с ацетатом (среда Б) или изоцитратом (среда В). Состав сред для отбора мутантов — продуцентов ИЛК приведен в табл. 1. Проверку образования органических кислот отобранными мутантами проводили на среде, содержащей мел (среда Г), обеспечивающей их накопление в куль-туральной жидкости. Для идентификации кислот отобранные мутанты выращивали в колбах в 50 мл питательной среды Д (табл. 1) в условиях интенсивной аэрации на качалке (220—240 об/мин) в течение 6 сут при 29°С. Значение рН поддерживали 10%-ным раствором КОН на уровне 4.5—6.0. Микроэлементы в среды добавлялись по Бурк-гольдеру [20]. В опытах с итаконовой кислотой использовали среду Д.
Культивирование отобранного мутанта У. ¡1-ро!уИса УФ/НГ проводили в ферментере SGI-500
БИОСИНТЕЗ ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ДРОЖЖАМИ Yarrowia lipolytica
253
(Франция) с объемом среды 220 л при 29.0 ± ±0.1°С, концентрации растворенного в среде кислорода 20—25% от насыщения в период роста и 50—55% в период образования кислот. рН среды поддерживали, равным 4.5 в период роста и 6.0 в период образования кислот добавлением 30%-ного раствора КОН. Состав среды (г/л): (МН4)28О4 — 3.0, М§8О4 • 7Н2О - 1.4, Са(МО3)2 - 0.8, ШС1 - 0.5 г, КН2РО4 - 2.0, К2НРО4 - 0.2, 2 объема раствора микроэлементов по Буркгольдеру, дрожжевой авто-лизат - 8 мл/л, тиамин - 1.2 мкг/л и Fe2+ - 1.2 мг/л. Начальная концентрация рапсового масла в среде составляла 20 г/л. При повышении рО2 на 5-10% по сравнению со стабильным уровнем насыщения кислородом его дополнительно вносили по 20 г/л. После прекращения роста культуры через 24 ч культивирования в питательную среду добавляли стерильный раствор итаконовой кислоты (3.9 г/л). Общая продолжительность культивирования составляла 6 сут.
Методы определения количества биомассы, содержания масла, азота, ЛК и ИЛК и расчет выхода ИЛК по массе (ТИЛК) описаны в работе [16].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Схема биосинтеза ЛК и ИЛК из рапсового масла дрожжами Y. lipolytica представлена на рис. 1 [16, 18]. Как видно на схеме триглицериды жирных кислот гидролизуются внеклеточной липазой с образованием глицерина и жирных кислот. Глицерин включается в обмен после фосфорилиро-вания глицеролкиназой (КФ 2.7.1.30). Окисление образовавшегося глицерол-3-фосфата в диокси-ацетонфосфат осуществляется при участии ФАД-зависимой глицерол-3-фосфат-дегидроге-назы (КФ 1.1.99.5). Превращение пирувата в аце-тил-КоА может протекать как через декарбоксили-рование пирувата до ацетил-КоА при участии пиру-ватдегидрогеназного комплекса (КФ 1.2.4.1), так и через карбоксилирование пирувата до оксалоацета-та пируват-карбоксилазой (КФ 6.4.1.1). В результате декарбоксилирования одной молекулы пирувата образуется ацетил-КоА и СО2, который используется в реакции карбоксилирования второй молекулы пирувата с образованием оксалоацетата. Для утилизации жирных кислот индуцируется глиоксилатный цикл, включающий два фермента: изоцитрат-лиазу (ИЦЛ, КФ 4.1.3.1) и малат-синтазу (КФ 4.1.3.2). Количество экскретируе-мых цитрата и изоцитрата, образованных в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), определяется соотношением активностей ферментов: цитрат-син-тазы (КФ 4.1.3.7), аконитат-гидратазы (КФ 4.2.1.3), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (ИЦДГ, КФ 1.1.1.41) и изоцитрат-лиазы. Можно предположить, что блокирование ЦТК и/или глиокси-латного цикла в условиях сверхсинтеза лимон-
Триглицериды 1
(
Глицерин 2
3-Ф-глицерин
3 J
3-Ф-дигидроксиацетон 1
ПВК
Жирные кислоты
Малат i i
ФК V
Глиоксилат
9
ИЛК
/
КГК
ЯК
Рис. 1. Схема окисления рапсового масла Y. lipolytica [18]
ПВК — пировиноградная кислота, КГК — а-кетоглу-таровая кислота, ЯК — янтарная кислота, ФК — фу-маровая кислота, ЩУК — щавелево-уксусная кислота; ферменты: 1 — липаза, 2 — глицеролкиназа, 3 — г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.