МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 916-923
ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.2:57.084.1:616-097
БИОСИНТЕЗ МИНИ-АНТИТЕЛ К ФЕРРИТИНУ ЧЕЛОВЕКА В РАСТИТЕЛЬНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРОДУЦЕНТАХ
© 2003 г. Е. Г. Семеншк*, О. А. Стремовский1,3, И. В. Орлова, Т. Г. Баландин1, А. М. Носов2,
Я. И. Бурьянов, С. М. Деев1, Р. В. Петров1
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии
наук, Пущино, Московская обл., 142290 1Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук,
Москва, 117997
2Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва, 127276 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 30.11.2002 г.
Осуществлена экспрессия генов рекомбинантных мини-антител к ферритину селезенки человека в виде слитого с барстаром белка в клетках Escherichia coli, трансгенных растениях и суспензионной культуре Nicotiana tabacum. Направление антител в эндомембранную систему растительных клеток обеспечивает стабильность и растворимость рекомбинантного белка, что подтверждено при помощи иммуноблотинга с антителами к барстару. Уровень продукции данного белка был одинаковым как в клетках растений родительских линий, так и растений первого поколения. Конъюгирование мини-антител с барстаром позволило осуществить не только иммунохимическое определение, но и очистку конъюгированных антител из растительного материала, основанную на взаимодействии иммобилизованной на металлоаффинном носителе барназы-И^б и барстара.
Ключевые слова: трансгенные растения, вариабельные домены антител, барстар, барназа.
Моноклональные антитела - незаменимый инструмент в медицинских и биологических исследованиях. Доменная структура иммуноглобулинов делает их чрезвычайно удобными для молекулярной инженерии, позволяя создавать рекомбинант-ные белки на основе укороченных фрагментов антител и модифицировать полноразмерные молекулы. Кроме того, на основе иммуноглобулинов могут быть получены конъюгаты с такими функциональными соединениями, как токсины, ферменты или радиоактивные атомы.
Технологии получения моноклональных антител различной специфичности, применяемых для диагностики заболеваний in vitro и биотехнологии, на сегодняшний день хорошо отработаны [1-3]. Для их производства широко используются гибри-домные культуры, клетки дрожжей и прокариот. Однако применение таких антител для терапии и диагностики in situ ограничено. Так, например, введение нативных моноклональных антител мыши в организм человека может стать причиной возникновения нежелательного иммунного ответа пациента на эти реагенты [4].
Эта проблема может быть решена путем использования не целой молекулы антитела, а лишь ее части, отвечающей за связывание чужеродно-
* Эл. почта: centaurea@mail.ru
го антигена, так называемого "минимального антитела" (мини-антитела), представляющего собой вариабельные домены (УН и УЬ) иммуноглобулина, соединенные пептидным линкером [5]. Для наработки мини-антител обычно используют бактериальные продуценты [3]. Однако суперпродукция рекомбинантных антител этого класса в клетках бактерий приводит к формированию нерастворимых и неактивных белковых агрегатов - телец включения. Для перевода их в растворимое состояние необходима денатурация и последующая ренатурация, что влечет за собой значительное снижение выхода белка и часто сопровождается потерей его функциональной активности [6]. В этом случае оптимальным подходом для получения растворимых антител может стать использование растительных продуцентов.
Последние достижения в области генной инженерии и биотехнологии растений позволяют считать растительные объекты очень перспективной системой для получения антител и их фрагментов. Клетки растений способны к сборке, посттрансляционной модификации и секреции полипептидных цепей иммуноглобулинов и обладают рядом преимуществ по сравнению с клеточными культурами прокариот, дрожжей и млекопитающих: 1) высокая эффективность генетической трансформации, 2) относительная простота
хранения и культивирования трансгенных линий, 3) возможность накопления чужеродного белка в запасающих органах, 4) высокая степень биологической безопасности процесса. Кроме того, крупномасштабное выращивание растений-продуцентов не требует больших материальных затрат [7].
В данной работе использована генетическая конструкция на основе вариабельных доменов антитела к ферритину селезенки человека (scFvFll), представляющего большую ценность для диагностики и терапии ряда онкологических заболеваний. Ферритин является антигеном, ассоциированным с опухолью: плоскоклеточным раком головы и шеи, раком печени, лимфогранулематозом и другими злокачественными новообразованиями. Радиоактивно меченые антитела к ферритину эффективны при использовании их для лечения карциномы печени и болезни Ходжкина [8].
В настоящем исследовании сконструированы гены трехдоменного слитого белка (scFvFllbarstar), составленного из двух доменов (VH и VL) антифер-ритинового мини-антитела и бактериального белка барстара [9] под контролем регуляторных элементов бактериальных и растительных клеток. Осуществлена экспрессия гена рекомбинант-ного белка в клетках E. coli, а также трансгенных растениях и суспензионной культуре растительных клеток. Использование барстара позволило нам осуществить иммунохимическое определение и эффективную очистку мини-антител из растительного сырья, основанную на реакции аффинного взаимодействия барназы и барстара.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Конструирование плазмиды и экспрессия гена антител к ферритину в клетках E. coli. Все генно-инженерные манипуляции, электрофорез ДНК, выращивание рекомбинантных штаммов, лизис клеток проводили по стандартным методикам [10]. Фрагмент ДНК, кодирующий одноцепочеч-ное мини-антитело scFll, амплифицировали с использованием плазмиды pETscFll в качестве матрицы [ll] и праймеров, содержащих сайты узнавания для рестриктаз Ndel и KpnI: 5'-GGA TCC ATG CAG GTG CAG CTG AAG CAG-3' и 3'-GTC GAC GGT ACC GAG ATC TCG TTT TAT TTC CAA C-5'. Продукт амплификации и плазмиду pET22b(+) расщепляли рестриктазами NdeI и KpnI, полученные фрагменты лигировали, после чего трансформировали лигазной смесью клетки E. coli xLl-Blue ("Stratagene", США). Полученная таким образом плазмида обозначена как pET22Fll. Фрагмент ДНК, кодирующий барстар, амплифицировали с использованием в качестве матрицы плазмиды pMT4l3 [l2] и праймеров, содержащих сайты узнавания для рестриктаз KpnI и HindIII: 5'-ATC TCG GTA CCG TCG ACA GCG CAT CTG CAG
CCG GCA TGA AAA AAG CAG TCA TTA ACG-3' и З'-CCA TTG AAG CTT TTA AGA AAG TAT GAT GGT G-5'. Продукт амплификации и плазмиду pET22F11 расщепляли рестриктазами HindIII и KpnI, полученные фрагменты лигировали и трансформировали ими клетки E. coli XL1-Blue. &руктура полученного гена в плазмиде pET22F11barstar подтверждена секвенированием ДНК по Cэнгeру [13]. Для получения рекомбинантного белка клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pET22F11barstar и выращивали их на жидкой питательной среде LB. На логарифмической стадии роста к клеткам добавляли изопропилтиогалак-тозид (ИПТГ) до конечной концентрации 0.1 мМ и инкубировали при 37°C и интенсивном перемешивании в течение 4 ч. Белки анализировали с помощью электрофореза в 12%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДОН) [14]. Электрофореграммы окрашивали кумасси R250.
Конструирование плазмиды для экспрессии гена антител в растениях. Генетическую конструкцию scFvF11barstar получали при помощи ПЦР, используя праймеры с сайтами для рестриктаз EcoRI и XbaI: 5'-ATC GTC TAG AAT GGC CCA GGT GC-3' и З'-CAT CAT ACT TTC TTA ACT TAA GGC AT-5'. В качестве матрицы использовали плазмиду pET22F11barstar. Полученный ПЦР-про-дукт клонировали в вектор pBluescript KS+ ("Stratagene", CШA) по сайтам EcoRI и XbaI. Олигонукле-отиды, кодирующие лидерный пептид цистеино-вой эндопептидазы клещевины ("Microsynth", Швейцария), содержали в своем составе сайты для рестриктаз SacII, EcoRI и XbaI: 5'-GG GAA TTC ATG CAA AAG TTT ATA CTT CTG GCT CTC TCA TTG GCT TTA GTT CTA GCA ATC ACG GAG AGT TTC GAT T-3' и З'-C GCC CTT AAG TAC GTT TTC AAA TAT GAA GAC CGA GAG AGT AAC CGA AAT CAA GAT CGT TAG TGC CTC TCA AAG CTA AGA TC-5'. Отжиг проводили при 65°C в течение 15 мин, затем смесь постепенно охлаждали до 20°C. Полученный таким образом двухцепочечный фрагмент лигировали с плазмидой pBluescript scFvF11 bar star, гидролизованной по сайтам полилинкера SacII и XbaI. Генетическую конструкцию, кодирующую целевой белок с лидерным пептидом LPscFvF11barstar встраивали в бинарный вектор для трансформации растений pSS [15] по EcoRI-сайту полилинкера. Этой плазмидой трансформировали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101(Gmr, Kmr, Rfr, vir-помощник pMP90RK) [16], как описано в работе [17].
В работе использовали растения табака Nicoti-ana tabacum L. (cv. Samsun). Растения культивировали при 26°C и 16-часовом фотопериоде, уровень освещения составлял 2 кЛюкс. Трансформацию листовых дисков проводили, как описано в руководстве [18]. Растения регенерировали на агаризованной среде MC [19], содержащей 1 мг/л
бензиламинопурина, 0.1 мг/л нафтилуксусной кислоты, 250 мг/л цефатоксима и 100 мг/л кана-мицина. Полученные регенеранты размножали черенкованием на этой же среде c антибиотиками, но без регуляторов роста. Для получения клеточных суспензий листья трансгенных растений, культивированных в условиях in vitro, переносили на среду МС, содержащую 0.2 мг/л бензиламинопурина, 1.5 мг/л дихлорфеноксиуксусной кислоты, 250 мг/л цефатоксима и 50 мг/л канамицина. Полученные каллусы через 4-6 недель переносили в жидкую среду МС того же гормонального состава. Клеточные культуры выращивали в колбах на качалке при 26°С. Продолжительность одного периода субкультивирования составляла 15-17 сут. Ростовые характеристики культуры определяли по изменению концентрации сухой биомассы, для чего клетки отделяли от жидкой среды на воронке Бюх-нера под вакуумом, двукратно промывали водой и высушивали при 60°С д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.