ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 2, с. 171-174
УДК 579.
БИОСИНТЕЗ ПОЛИГИДРОКСИБУТИРОВАЛЕРАТА С РАЗНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ ПРИ РОСТЕ Methylobacterium extorquens G-10 НА СМЕСИ МЕТАНОЛА И ПЕНТАНОЛА
© 2013 г. В. А. Ежов, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область 142290;
e-mail: trotsenko@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 23.08.2012 г.
Изучено влияние концентрации и времени добавления косубстрата (пентанола) на молекулярную массу (Мм) сополимера полигидроксибутировалерата (ПГБВ), синтезируемого Methylobacterium extorquens G-10 при выращивании на среде с метанолом. Показано, что увеличение концентрации пентанола до 20% в смеси с метанолом стимулировало биосинтез ПГБВ с Мм ~1500 кДа и содержанием валерата до 50%, особенно при добавлении пентанола в логарифмической фазе роста культуры. Высокие концентрации пентанола токсичны для продуцента и снижали общий выход ПГБВ. Увеличение Мм до 1500 кДа снижает температуру плавления биополимера (с 172 до 162°С) и степень кристалличности (с 63 до 8%), но повышает его эластичность. Обнаруженная вариабельность свойств ПГБВ значительно расширяет сферы потенциального применения синтезируемых биопластиков.
DOI: 10.7868/S0555109913020049
Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) — полиэфиров микробного происхождения, явилось значительным событием для биотехнологии новых материалов. ПГА — термопластичные, биоразлагаемые и биосовместимые полимеры, потенциальные области применения которых включают биомедицину, пищевую и косметическую промышленность, производство упаковочных материалов и сельское хозяйство [1, 2].
К настоящему времени описано более 300 продуцентов ПГА и около 150 различных поли-гидроксиалкановых кислот [3, 4]. Однако наибольшую коммерческую ценность представляют полигидроксибутират (ПГБ) и сополимер 3-гид-роксибутирата (3-ГБ) с 3-гидроксивалератом (ПГБВ). Введение 3-гидроксивалерата (3-ГВ) в ПГБ существенно улучшает физико-химические свойства сополимера. ПГБВ обладает пониженной температурой плавления (увеличивается технологическое "окно перерабатываемости" между температурами плавления и началом термического разложения), большей эластичностью и прочностью [1—6]. Для биосинтеза ПГБВ необходимо добавлять в основную ростовую среду косубстраты. Наиболее эффективными косубстратами являются пентанол или пентановая кислота [7—10]. В качестве основных ростовых субстратов для биосинтеза полимеров чаще всего используют углеводы [11—17]. В России дешевым источником углерода является метанол, производство которого составляет около 3 млн т. ежегодно. Аэробные метилобактерии с сериновым путем метаболизма
С1-соединений синтезируют из метанола 40—80% ПГБ от сухой биомассы [8, 10, 12, 15]. При добавлении к метанолу в качестве косубстрата пента-нола или пентановой кислоты метилобактерии синтезируют ПГБВ, однако характеристики процесса изучены недостаточно [7—10].
Цель работы — изучение условий биосинтеза ПГБВ при выращивании Ме1ку1оЬас1егшт ехОщиет 0-10 на смеси метанола и пентанола, а также характеристика основных физико-химических свойств сополимера.
МЕТОДИКА
Объекты и условия культивирования. МеЛуОЬас-1епит ехОщиет 0-10 выращивали на минеральной среде, следующего состава (г/л): КН2Р04 — 1.0; Ма2ИР04- 12Н20 - 1.0; (МН4)2804 - 1.0; Ы§804 •
• 7Н20 — 0.1; 10 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов содержал (г/л): СоС12 • Н20 — 0.5; СаС12 • 6Н20 — 0.5; Мп804 • Н20 — 0.2; 2п804 •
• Н20 — 0.5; №Мо04 — 0.02; Си804 • 5Н20 — 0.1; Бе804 • 7Н20 — 1.0. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со 100 мл среды и 0.5 мл метанола при 29°С на роторной качалке (180 об/мин) в течение 2 сут. Культуру в середине логарифмической фазы роста (ОП600 = 1.0) использовали в качестве посевного материала (инокулята) для ферментера. Периодическое культивирование в ферментере АНКУМ-2М ("Биоприбор", Россия) проводили в режиме автоматического поддержа-
172
ЕЖОВ и др.
ния температуры 30°С и рН 6.85. В ферментер вносили 4.0 л минеральной среды и 200 мл посевного материала. рН поддерживали 25%-ным NH4OH или 10%-ным раствором NaOH. При достижении культурой ОП600 = 30 добавляли 50 мл концентрата среды, содержащего (г/л): H3PO4 — 270; MgSO4 • • 7H2O - 80.0; FeSO4 • 7H2O - 2.3; CaCl2 • 6H2O - 0.6; MnSO4 • H2O - 0.3; CoCl2 • H2O - 0.5; ZnSO4 • H2O -0.6; CuSO4 • 5H2O - 0.4. Метанол добавляли дробно (порциями от 5 до 20 мл) по мере потребления растущей культурой, о чем судили по резкому увеличению уровня растворенного кислорода (рО2) в момент полного потребления метанола. рО2 поддерживали на уровне 20-30% от насыщения посредством увеличения числа оборотов мешалки до 1000 об/мин и расхода воздуха до 6 л/мин.
Пентанол добавляли в смеси с метанолом при достижении культурой разных фаз роста и до конца культивирования. Использовали 2, 10, 15 и 20% (по объему) концентрации пентанола в метаноле. Постепенное (дробное) внесение пентанола в среду позволяло снизить его токсическое влияние на растущую культуру.
Содержание биомассы определяли, измеряя оптическую плотность (ОП600) в 0.5 см кювете на спектрофотометре Specol 221 ("Carll Zeiss", Германия) и пересчитывали на сухую биомассу по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой отбирали по 50 мл суспензии клеток с известной ОП, центрифугировали (10000 g, 20 мин), полученный осадок сушили при 105°С до постоянной массы и взвешивали.
Содержание NH+ в культуральной среде анализировали иономером МА-130 ("Mettler Toledo GmbH", Швейцария) с аммонийным датчиком.
Для выделения ПГБ и ПГБВ из биомассы куль-туральную жидкость центрифугировали (10000 g, 30 мин), осадок сушили лиофильно. Навеску высушенной биомассы перемешивали с 6 об. метанола в течение 1 ч и центрифугировали при 5000 g 20 мин. Полученный осадок при перемешивании экстрагировали 6 об. хлороформа в течение 3 ч. Суспензию фильтровали через обеззоленную фильтровальную бумагу. Хлороформенный экстракт осветляли активированным углем марки А, который отделяли затем на воронке Бюхнера под вакуумом. Осветленный экстракт упаривали на роторном испарителе в 5-6 раз (до состояния жидкого киселя). Концентрат при энергичном перемешивании выливали в 6-кратный об. метанола. Выпавший осадок ПГБ или ПГБВ отделяли на воронке Бюхнера и сушили при 105°С.
Содержание ПГБ в биомассе и соотношение 3-ГБ и 3-ГВ в ПГБВ определяли обращенно-фазо-вой ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой С18 [16]. Для этого образцы ПГБ гидролизовали концентрированной серной кислотой, а образцы
ПГБВ гидролизовали щелочью до кротоновой и метилкротоновой кислот, гидролизаты наносили на колонку. Через колонку пропускали элюент (смесь метанол—вода 1 : 1) со скоростью 0.4 мл/мин и элюаты анализировали при 228 нм на УФ-детек-торе UVIS 200 ("Linear", США). По калибровочной кривой определяли количество ПГБ и количество 3-ГБ и 3-ГВ в сополимере.
Мм полимеров определяли вискозиметриче-ским методом, измеряя вязкость растворов ПГБ и ПГБВ в хлороформе при 30°С [13]. Мм рассчитывали по уравнению Марка-Хаувинка-Куна, используя коэффициент [п] = 7.7 х 10-5 М0 82 [17]. Температуру плавления (t, °C) ПГБ и ПГБВ, теплоту плавления (Дж/г), степень кристалличности и удлинения (%) при разрыве определяли методами дифференциального термического анализа на приборе STA 449 ("Jupiter NETZSCH", Германия) и рентгеноструктурного анализа (рентгеноспек-трометр D8 ADVANCE "Bruker", Германия) соответственно [18]. Все опыты проводили в трех по-вторностях. В таблицах приведены средние значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
М. ех1ощыет 0-10 — аэробная метилобактерия с сериновым типом С1-метаболизма, синтезирующая при выращивании на минеральной среде с метанолом ПГБ или ПГБВ при использовании смеси метанола с пентанолом. Данные по биосинтезу ПГБВ при дробном внесении 15%-ной смеси пентанола в метаноле на различных стадиях роста культуры представлены в табл. 1. Переход на поддержание рН посредством подачи в ферментер 10%-ного раствора №ОИ для создания лимита по азоту осуществляли при достижении культурой ОП600 = 70. Чем раньше добавляли пентанол к культуре, растущей на метаноле, тем быстрее начиналось угнетение роста продуцента. При этом резко снижалось количество синтезируемого ПГБВ, но увеличивалась доля валерата и Мм сополимера. Добавление пентанола в конце логарифмической фазы в меньшей степени угнетало рост продуцента, при этом увеличивался биосинтез полимера, но уменьшалась его Мм. Из этого следовало, что добавлять пентанол целесообразно до перехода к поддержанию рН с помощью №ОИ, особенно, если ставится задача получения биополимера с высокой Мм.
Во второй серии опытов исследовали влияние концентрации пентанола на рост культуры и биосинтез ПГБВ. Смесь пентанола с метанолом различной концентрации начинали подавать в ферментер при достижении ОП600 = 70, т.е. в середине логарифмической фазы роста культуры. Как видно из табл. 2, с увеличением концентрации пента-нола значительно возрастали содержание валера-
БИОСИНТЕЗ ПОЛИГИДРОКСИБУТИРОВАЛЕРАТА 173
Таблица 1. Влияние косубстрата (15%-ный пентанол в метаноле) на рост М. extorquens 0-10 и биосинтез ПГБВ
Условия роста Конечное содержание полимера в биомассе, % Содержание валерата в ПГБВ,% Мм ПГБВ, кДа
ОП600 в момент внесения пентанола конечные значения
ОП600 АСБ, г/л
30 50 15 30 45 1200
50 95 27 38 36 930
70 110 38 41 13 425
90 130 52 45 0 250
Таблица 2. Влияние концентрации пентанола на рост М. ех^щиет 0-10 и биосинтез ПГБВ с различной Мм
Концентрация пентанола в метаноле, % (об./об.) Биомасса, г/л Содержание, % Мм полимера, кДа
полимера в биомассе валерата в полимере
0 48 53 0 196
2 40 45 13.6 305
10 31 40 36.0 800
15 28 38 41.0 1150
20 25 30 50.0 1500
та, а также Мм сополимера. При содержании 20% (об.) пентанола в смеси с метанолом доля валера-та в сополимере достигала 50%. Увеличение концентрации пентанола в смеси значительно снижало скорость роста культуры и выход ПГБВ, что может быть связано с его токсичностью. Токсичность для клеток бактерий пентанола и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.