ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 140-150
УДК 579.2:579.6+577.1
БИОСИНТЕЗ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ МЕТАНОТРОФАМИ: БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ (ОБЗОР)
© 2015 г. В. Н. Хмеленина*, О. Н. Розова*, С. Ю. Бут*, И. И. Мустахимов*, **, А. С. Решетников*, А. П. Бесчастный*, Ю. А. Троценко* **
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Московской обл., 142290 **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино Московской обл., 142290
e-mail: trotsenko@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.09.2014 г.
В обзоре суммированы представления о метаболическом потенциале метанотрофов как продуцентов биополимеров, альтернативного биотоплива, биопротекторов и других вторичных метаболитов. Приведены примеры современных 'омик'-технологий, используемых для генно-инженерного конструирования эффективных метанотрофных продуцентов.
Ключевые слова: метанотрофные бактерии, гены и ферменты, метанобактин, биополимеры, биопротекторы, эктоин, сахароза, пирофосфат-зависимый гликолиз.
DOI: 10.7868/S0555109915020087
Метан (СН4) — один из наиболее опасных парниковых газов и доминирующая часть природного газа, а также побочный продукт при добыче угля и нефти, значительная часть которого в России сжигается или выделяется в атмосферу. Кроме того, метан преобладает в составе биогаза, образуемого метаногенными археями в природных и антропогенных источниках. В последнее время проблема утилизации метана обострилась в связи с ограничением выброса СО2, образующегося при сжигании попутного газа, а также разработкой сланцевого газа, при которой его сжижение или строительство газопроводов, как правило, нерентабельно. Необходимость борьбы с глобальным потеплением и разработка технологий получения полезных полиуглеродных соединений из непищевого сырья стимулировало изучение уникального метаболизма метанотрофов — структурно и функционально специализированной группы аэробных бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Цель этих исследований — создание научных основ биотехнологий биосинтеза из метана целевых продуктов хозяйственного и медицинского назначения (биодобавок, биополимеров, биопротекторов, нового биотоплива, препаратов защиты окружающей среды), а также биоаналитических агентов (ферменты). Появление в Database аннотированных последовательностей геномов позволяет пересмотреть сформированные в догеномную эпоху представления о метаболическом потенциале метанотрофов, путях С1-окисления и ассими-
ляции, их регуляции на уровне транскрипции генов и свойств ферментов, что, в свою очередь, способствует выбору и целенаправленному генно-инженерному конструированию эффективных штаммов-продуцентов.
Большинство проводимых в последнее десятилетие исследований биотехнологического потенциала метанотрофов направлено на изучение процессов трансформации Сгсоединений, а также синтеза витаминов, антибиотиков, органических и аминокислот, биополимеров и белка одноклеточных [1—5].
Разнообразие, филогения и метаболизм метанотрофов. Согласно структурно-функциональным особенностям и филогенетическому положению, аэробные метанотрофы отнесены к трем основным группам [6, 7]. Группа I (типы I и X) включает метанотрофы 10 родов: МеЛу1отопаз, МеЖу1о-Ьас1ег, МеЛуЬзагста, МеЖуЬтюгоЬшш, МеАуЬИа-1оЬш, МеЛуЬзрНаега, МеЛу1озота, МеЛуЫНегтш, МеЛуЬеаМыт и МеЛу1ососст (класс Оаштарго1ео-Ьайепа). Как правило, эти бактерии ассимилируют С1-соединения рибулозомонофосфатным (РМФ) путем, в котором из формальдегида (ФА) и рибуло-зо-5-фосфата с участием уникальных для данного пути ферментов (гексулозофосфатсинтазы и гексу-лозофосфатизомеразы) синтезируется фруктозо-6-фосфат. Исключение составляют представители родов Ме1ку1осаШыт и Ме1Ну1ососст (тип X), реализующие три известных пути С1-ассимиля-ции. Бактерии с РМФ-циклом формируют внут-рицитоплазматические мембраны (ВЦМ) I типа
в виде уплощенных дисков, где происходит первичное окисление метана мембранной метанмо-нооксигеназой (мММО), и имеют дефектный по а—кетоглутаратдегидрогеназе цикл Кребса. Группа II (тип II) включает бактерии родов Methylosi-пш, Methylocystis, Methylocella, Methylocapsa и Me-thyloferula (класс А1рИарго1еоЪас1ег1а), которые ассимилируют Сгсоединения в сериновом цикле, где из ФА и С02 сначала образуются С3- и ^-соединения, а затем ацетил-КоА, в котором половина углерода происходит из С02. Функциональный ЦТК имеет биосинтетическую направленность ввиду низкой активности а-кетоглутаратдегидро-геназы. Метанотрофы II группы, как правило, формируют ВЦМ II типа, повторяющие контуры цитомембраны, за исключением представителей рода Methylocella, которые не образуют развитой системы ВЦМ и имеют только растворимую форму ММО [6, 8-10]. В III группу отнесены термоацидофильные метанотрофы рода Methylacidiphi-lum (филум УеггисошсгоЫа), ассимилирующие углерод метана на уровне С02 через цикл Кальвина и формирующие карбоксисомы вместо ВЦМ [11].
Метанотрофы как потенциальные продуценты биотоплива. В настоящее время большое внимание уделяется разработке процессов получения альтернативного топлива, в частности, биодизеля на основе растительных (рапс, соя, пальмовое, касторовое и кокосовое масла и др.) или животных жиров (масел). Однако развернутая полемика относительно использования кормового и пищевого сырья для получения топлива, приводит к расширению исследований по получению биотоплива из непищевых источников с помощью микроорганизмов, таких, как олеогенные дрожжи и микроводоросли [12]. Метанотрофы с развитой системой ВЦМ характеризуются высоким содержанием липидов (до 20% массы клеток), которые могут служить предшественниками биотоплива, получаемого посредством их гидрогенизирования [13]. Анализ стоимости сырья свидетельствует о том, что дизельное топливо из метана может успешно конкурировать с производимым из нефти [14]. Для микроорганизмов, использующих углеводы в качестве ростового субстрата, теоретический выход по этанолу, бутанолу или липидам составляет 0.51, 0.41 и 0.35 г/г соответственно [12]. Согласно стехиометрическому уравнению, метанотрофы имеют выход по метану 1.0 г веса сухих кл./г СН4 [15]. Учитывая максимальное содержание липидов у метанотрофов, необходимо повышение их уровня до 35% для создания экономически выгодного процесса с их использованием. Однако перспектива получения биодизеля из метана все еще далека от практической реализации, в противоположность успехам, достигнутым в получении био-
топлива в виде этанола, бутанола или биодизеля из других источников.
Пути решения данной проблемы включают исследование штаммов, способных к высокой скорости трансформации СН4 в свободные жирные кислоты при оптимизации условий роста и биосинтеза. Основные теоретические предпосылки получения жидкого топлива из метана суммированы в обзорах [14, 16]. Показано, что метанотрофы могут проявлять максимальную активность мММО и высокую степень развития ВЦМ при концентрации меди в среде культивирования >0.85 мкмоль/ г сухих клеток, при низком содержании меди уровень мембран снижается. Для ме-танотрофов класса Gammaproteobacteria необходимы более высокие концентрации меди в среде по сравнению с метанотрофами класса Alphaproteo-bacteria [17].
Жирные кислоты липидов метанотрофов — либо насыщенные, либо мононенасыщенные с длиной цепи С14—С18 и различным положением двойной связи, являются идеальными источниками дизельного топлива. Однако метанотрофы содержат также фосфолипиды, присутствие которых может осложнять процесс получения биотоплива, поскольку нежелательные компоненты (сахара, фосфор и сера) вызывают проблемы в технологическом процессе, такие, как гуминизация и инактивация катализа при гидрогенировании [14]. Метанотрофы синтезируют два основных класса фосфолипидов - фосфатидилглицерин (ФГ) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ), а также производные фосфатидилэтаноламина - фосфа-тидилметилэтаноламин (ФМЭ) и фосфатидилди-метилэтаноламин (ФДМЭ) [18]. Фосфатидилсе-рин (ФС) практически отсутствует в мембранах метанотрофов, очевидно, вследствие активных ферментов декарбоксилирования, которые превращают ФС в ФЭ, и метилаз, модифицирующих ФЭ в ФМЭ и ФДМЭ. В фосфолипидах гаммапро-теобактериальных метанотрофов доминируют ФГ и ФЭ с гексадеценовой кислотой (С16:1 ), тогда как у альфапротеобактериальных метанотрофов содержание ФГ и ФМЭ почти одинаково, а основной жирной кислотой является октадеценовая (С18:1) [17]. Один из путей реализации получения биотоплива из метана — создание генно-инженерных штаммов метанотрофов с более высоким содержанием свободных жирных кислот.
Метанобактин — витальный Си-хромопептид.
Медь играет ключевую роль в метаболизме метано-трофов, поскольку присутствует в активном центре мММО и существенно повышает активность фермента [16]. Для поглощения и доставки меди к активному центру мММО некоторые метанотрофы синтезируют и секретируют в среду хромопептид метанобактин (Мб) — медь хелатирующее соедине-
ние с ММ 1.2 кДа, имеющее экстремально высокое сродство к данному металлу >1021 М-1 [19—21]. Мб секретируется в среду в апо-форме, и в виде комплекса Cu-Мб транспортируется в клетки бактерий [20]. Данная структурно-функциональная модель Мб напоминает таковые для сидерофоров, по аналогии с которыми метанобактин называют шалкофором [19] (chalko — в переводе с греческого медь, sidero — железо). Мб может быть использован для удаления меди из стоков полупроводниковой промышлености [22], лечения болезни Вильсона, нарушений метаболизма меди у человека [23], извлечения меди из нерастворимых минералов [24].
Структура метанобактинов расшифрована с использованием масс-спектрометрии, ЯМР и кристаллографии. Мб координируют медь двумя азотсодержащими гетероциклами, сопряженными с тиоамидными группами и окруженными пептидным остовом, состав которого может варьировать [19, 25, 26].
Кроме Cu(II) или Cu(I), Мб связывает другие металлы, включая Hg (II), Ag(I), Au(III), Co(II), Cd(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(VI) или Zn(II), но не Ba(II), Ca(II), La(II), Mg(II) и Sr(II). Однако константа связывания других металлов меньше, чем
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.