МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 1, с. 41-48
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.835:62(577.152.1)
БИОСИНТЕЗ ЗОЛОТЫХ НАНОЧАСТИЦ БАКТЕРИЯМИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
© 2014 г. М. А. Купряшина1, Е. П. Ветчинкина, А. М. Буров, Е. Г. Пономарева, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов
Поступила в редакцию 29.04.2013 г.
Показана способность почвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense к восстановлению золота из золотохлористоводородной кислоты до элементного состояния и формированию золотых наночастиц. Установлено участие бактериальных внеклеточных фенолокисляющих ферментов (лакказ и Mn-пероксидаз) в восстановлении Аи+3 до Au0 из HAuCl4. С использованием просвечивающей электронной микроскопии было показано накопление наночастиц коллоидного золота различной геометрической формы в культуральной жидкости штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7. Размер синтезированных электронно-плотных наносфер колебался в пределах 5—50 нм; нанопризм — от 5 до 300 нм. Рассмотрен предполагаемый механизм образования золотых наночастиц.
Ключевые слова: бактерии рода Azospirillum, образование золотых наночастиц, лакказа, Мп-пероксидаза.
DOI: 10.7868/S0026365614010078
В последние годы коллоидное золото широко применяется в различных областях медицины, биохимии, иммунологии и технологии [1]. Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений в области нанотехнологий является исследование свойств и разработка вариантов получения золотых наночастиц. Широко распространенным способом является химическое восстановление золота редуцирующими агентами. Однако, несмотря на успешное применение данных методов, они зачастую остаются дорогостоящими и требуют использования экологически опасных химических соединений. В связи с этим возрастает интерес к биологическому, так называемому "зеленому" синтезу, с применением, в частности, микробных биотехнологий [2].
Исследователи отмечают способность бактерий к восстановлению золота из золотосодержащих соединений до элементного состояния с образованием золотых наночастиц. Причем образование частиц происходит как внеклеточно (Lactobacillus sp., Rhodopseudomonas capsulata, Pseudomonas aeruginosa) [3—5], так и внутри клеток Shewanella algae и Stenotrophomonas maltophilia [6, 7]. Ничего не известно о восстановлении золота почвенными бактериями рода Azospirillum, относящимися к азотфиксиру-ющим микроорганизмам, способным образовывать ассоциации с растениями и стимулировать их рост и развитие. Также неизвестно, какие ферменты участвуют в биовосстановлении золота до элементного состояния. Относительно недавно появилось упо-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kupryashina_m@mail.ru).
минание о возможности участия фенолоксидаз в данном процессе [8]. На сегодняшний день отсутствуют экспериментальные данные по образованию золотых наночастиц под действием гомогенных ферментов.
Вышесказанное определило цель данного исследования: изучить способность А. ЬгазИете к восстановлению золота до элементного состояния с образованием наночастиц и определить роль лакказ и Мп-пероксидаз в этом процессе. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Организмы и условия культивирования. В качестве объектов исследования были использованы штаммы из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН: А. ЬгазИете 8р245 и А. ЬгазИете 8р7. Бактерии культивировали при температуре 37°С в жидкой малатно-солевой среде (г/л): КН2Р04 — 0.1; К2НР04 - 0.4; ШС1 - 0.1; Ш2Мо04 • 7Н20 - 0.002; М§804 • 7Н20 - 0.2; FeS04 • 7Н20 - 0.02; яблочная кислота - 5; Ш0Н - 1.7; МН4С1 - 1; СаС12 - 0.02; М^04 • 5Н20; рН 6.8 [9]. Посевным материалом служила 12-часовая культура, выращенная на среде того же состава. Стартовая плотность культуры во всех опытах составляла 2 х 107 кл./мл. Через 24 ч культивирования в стерильных условиях в среду вносили водный раствор НАиС14 С^1§та-АЫг1сИ", США) в диапазоне концентраций от 5 до 500 мкМ.
Влияние золотохлористоводородной кислоты на рост бактерий и определение минимальной ингибирующей рост и минимальной летальной концентраций оценивали по изменению оптиче-
ской плотности бактериальной суспензии через 18 ч культивирования с HAuCl4 по сравнению с контрольным вариантом. Для анализа числа жизнеспособных клеток использовали стандартный метод определения КОЕ.
Определение активности ферментов. Активность Mn-пероксидазы определяли спектрофо-тометрически при длине волны 468 нм по скорости окисления 2,6-диметоксифенола ("Sigma", США) [10], активность лакказы — по скорости окисления 2,2'-азино-бис(3-этилбен-зотиазолин-6-сульфоната) (АБТС; "Sigma", США) до устойчивого катион-радикала при длине волны 436 нм [11].
Выделение и очистка ферментов. Для выделения Mn-пероксидазы и лакказы использовали 36-часовую культуру бактерий. Клетки осаждали в течение 15 мин при 7000 g на центрифуге К-24 ("MLV", ГДР). Супернатант использовали для дальнейшей очистки. Первая стадия включала дробное осаждение белков культуральной жидкости сульфатом аммония 0—85%, вторая стадия — селективную сорбцию примесей на геле CaF2 (за основу взят метод, предложенный Новаковским с соавторами [12]). Далее проводили гельпроникаю-щую хроматографию на колонке с Sephadex G-75 ("Sigma-Aldrich", Швеция). Выход белковых фракций, элюированных 0.1 М NaCl, регистрировали на приборе Uvicord S-II ("LKB", Швеция) при X = 280 нм. Следующая стадия включала ионообменную хроматографию на носителе Toyopearl DEAE-650M ("Tosoh", Япония), размер частиц 10—40 мкм. Связавшиеся с носителем белки элюи-ровали ступенчатым градиентом от 0 до 1 М NaCl. Фракции, обладающие Mn-пероксидазной и лак-казной активностью, диализовали против воды и использовали в эксперименте. Исследование компонентного состава белков на каждой стадии очистки, а также гомогенность полученных препаратов ферментов и их молекулярную массу определяли с помощью ДДС-№-ПААГ-электро-фореза по Лэмли [13] в 12.5% полиакриламидном геле. На всех этапах очистки проводили измерение лакказной и Mn-пероксидазной активности.
Для исследования участия фенолоксидаз в образовании золотых наночастиц водные растворы очищенных ферментов инкубировали с 30 мкМ HAuQ4 при комнатной температуре 24—48 ч.
Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ microscopy). Образцы целых бактериальных клеток и культуральной жидкости исследовали при помощи метода негативного контрастирования. Материал наносили на никелевые сеточки с подложкой (1% раствор формвара в дихлорэтане). После высыхания клетки контрастировали 1% водным раствором уранилацетата [14]. Микрофотографии были получены на электронном микроскопе Libra 120 ("Carl Zeiss", Германия) при 120 кэВ.
Характеристика наночастиц. Для анализа спектров поглощения наночастиц использовали спектрофотометр Specord 250 ("Analytik Jena", Германия, 190—1100 нм). Оценку размера, формы и относительного количества электронно-плотных нанообразований проводили с помощью трансмиссионных электронно-микроскопических изображений (ТЭМ), полученных на электронном микроскопе Libra 120 ("Carl Zeiss", Германия). Для измерения дзета-потенциала, среднего размера и распределения синтезированных частиц Аи0 по размеру использовали прибор Zetasizer Nano ZS ("Malvern", Великобритания).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние золотосодержащего соединения BAuQ4 на рост бактерий. Первоначально была протестирована чувствительность штаммов микроорганизмов к золотохлористоводородной кислоте, влияние данного соединения на ростовые характеристики и накопление бактериальной биомассы при культивировании на жидкой питательной среде. В 24-часовую культуру бактерий был добавлен водный раствор кислоты НАиС14 в диапазоне концентраций от 5 до 500 мкМ, и через 18 ч инкубации определены концентрации, характеризующие токсичность золотосодержащего соединения. Минимальная ингибирующая рост концентрация составляла 40 мкМ, при 100—500 мкМ рост полностью отсутствовал, а при 5 мкМ фактически не изменялся по сравнению с контролем.
Было отмечено, что в присутствии НАиС14 в диапазоне концентраций 5—30 мкМ при культивировании A. brasilense Sp245 и Sp7 в жидкой синтетической, среде на вторые сут среда начинала приобретать слабое сиреневое окрашивание, которое с течением времени (72 ч) становилось более интенсивным. Согласно литературным данным, такое окрашивание характерно для бактерий, водорослей и грибов, растущих на золотосодержащих средах, и указывает на накопление в культу-ральной жидкости наночастиц золота [15]. Контрольные культуры бактерий имели кремово-белый цвет на протяжении всего времени культивирования, среда также не меняла окраску. В синтетической среде того же состава с внесенной НАиС14 в концентрациях от 5 до 500 мкМ без инокуляции бактерий в течение 72 ч изменения цвета и выпадения осадка не происходило. Это свидетельствовало о том, что процесс образования золотых наночастиц в данном случае не связан с химическим восстановлением золота под действием компонентов среды культивирования.
Для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация НАиС14 30 мкМ, при которой не наблюдалось ингибирования бактерий и отмечалось сиреневое окрашивание среды культивирования.
Электронная просвечивающая микроскопия. С
применением просвечивающей электронной микроскопии и метода негативного контрастирования были исследованы культуральная жидкость и бактериальные клетки двух штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, выращенных в течение двух (рис. 1а, 1б) и трех суток в присутствии 30 мкМ HAuCl4. Как видно на представленных рисунках, в культураль-ной жидкости и около бактериальных клеток, наблюдаются электронно-плотные образования различной формы, при этом размер частиц сильно варьирует. С увеличением времени культивирования количество наночастиц возрастает.
Для изучения наночастиц из восстановленного A. brasilense Sp245 и Sp7 золота, культуральную среду отделяли от бактериальных клеток через фильтр с размерами пор 0.45 мкм и подвергли лио-филизации. Далее лиофилизат с наночастицами ресуспензировали в дистиллированной воде и наносили на никелевые сеточки с подложкой. Отделенные фильтрованием частицы золота пред
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.