ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ
11, 615
БИОСОВМЕСТИМОСТЬ НАНОСТРУКТУРНОГО НИТИНОЛА С ПОВЕРХНОСТНЫМИ КОМПОЗИЦИОННЫМИ СЛОЯМИ ИЗ ТИТАНА ИЛИ ТАНТАЛА, СФОРМИРОВАННЫМИ МЕТОДОМ МАГНЕТРОННОГО НАПЫЛЕНИЯ
© 2015 г. Е. О. Насакина, А. С. Баикин, К. В. Сергиенко, М. А. Севостьянов, А. Г. Колмаков, Б. А. Гончаренко, В. Т. Заболотный, Р. С. Фадеев, И. C. Фадеева, С. В. Гудков, академик РАН К. А. Солнцев
Представлено академиком РАН А.Ю. Цивадзе 30.09.2014 г. Поступило 02.09.2014 г.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 1, с. 49-52
УДК 620.
Б01: 10.7868/80869565215070142
Несмотря на то, что поиск материалов для медицинских имплантатов продолжается уже более двух столетий, существующие материалы, особенно металлические, не являются индифферентными для организма человека [1]. После имплантации таких материалов довольно часто наблюдаются различные отрицательные реакции организма пациента, заключающиеся в развитии металлозов, отторжении или фиброзном перерождении прилежащих тканей. Одновременно с этим отсутствие биологически инертного барьера на границе соприкосновения поверхности металлической части имплантата с активными биологическими жидкостями организма может привести к поверхностной коррозии и, следовательно, к потере таких основополагающих свойств имплантата, как прочность и пластичность [2]. Благодаря высокой коррозионной стойкости, быстрой пассивации, легкому формированию устойчивых оксидов именно титан и его сплавы одними из первых металлов были использованы для изготовления медицинских имплантатов [3]. В настоящее время наиболее распространенным медицинским сплавом титана является нитинол (никелид титана №-И). Несмотря на такие свойства нитинола, как
Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова
Российской Академии наук, Москва E-mail: baikinas@mail.ru
Институт теоретической и экспериментальной биофизики
Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская обл. Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской Академии наук, Москва
сверхэластичность и память формы, присутствие в его составе большого количества высокотоксичного никеля долгое время препятствовало его массовому применению в медицине. В свете сказанного выше очевидно, что наличие на поверхности нитинола стойкого барьерного биоинертного слоя, ограничивающего попадание никеля во внутреннюю среду организма, позволило бы существенно снизить потенциальные риски токсических реакций и защитить изготовленный из этого материала имплантат от повреждений.
Сейчас известно множество различных технологий модифицирования поверхностных слоев нитинола углеродом, кремнием, а также их различными соединениями и металлами (Ti, Ta, Au, Ag, Pt и т.д.) [4]. Большинство указанных модификаций существенно улучшали биосовместимость, однако стойкость таких покрытий оставляла желать лучшего. В настоящее время проблема биостойкости нитинола в значительной степени решена с помощью метода магнетронно-го распыления химически чистых титана и тантала [5], однако биосовместимость таких композитов с тканями человека не известна.
Цель этой работы заключалась в исследовании биосовместимости наноструктурного нитинола [NiTi (55.91 мас. % Ni - 44.03 мас. % Ti)] с поверхностными композиционными слоями из титана (Ti@NiTi) или тантала (Ta@NiTi), сформированными методом магнетронного напыления.
Как указывалось выше, наличие тонких безникелевых барьерных слоев, сформированных на поверхности нитинола, приводит к существенному повышению его коррозионной стойкости [4], а титан и тантал имеют гораздо более низкую токсичность по сравнению с никелем [6, 7]. Композит "подложка из нитинола — поверхностный слой" получали на комплексе фирмы "Torr Inter-
4
49
50
НАСАКИНА и др.
Таблица 1. Влияние нитинола и нитинола с поверхностными композиционными слоями на основе тантала или титана на образование пероксида водорода (40°С, 200 мин) и гидроксильных радикалов (80°С, 120 мин) в водных растворах под действием тепла
Воздействие А [Н2О2] А fOH]
нМ
Контроль 3.2 ± 0.2 * 14.3 ± 0.9 *
NiTi 10.7 ± 0.8 120.7 ± 4.9
Ta@NiTi 4.5 ± 0.3 * 30.9 ± 2.0 *
Ti@NiTi 6.5 ± 0.5 * 26.1 ± 1.3 *
* Отличие относительно группы NiTi достоверно, p < 0.05 (i-критерий Стьюдента).
national" (США) с использованием метода магне-тронного распыления [5] в газовой среде аргона при остаточном давлении менее 0.5 мПа и рабочем давлении ~0.4 Па. Магнетрон с мишенью из химически чистого тантала или титана работал на постоянном токе 860 мА при дистанции напыления 150 мм от подложки, напряжении 400 В и времени напыления 3 ч. Перед напылением подложки подвергали предварительному ионному травлению (очистка, активация и полировка поверхности при бомбардировке ионами аргона). Температура на поверхности подложек не достигала 150°C.
Известно, что на молекулярном уровне токсический эффект ионов никеля и других металлов переменной валентности реализуется за счет их влияния на генерацию активных форм кислорода и за счет взаимодействий с белками и нуклеиновыми кислотами [8]. В связи с этим было исследовано влияние наноструктурного нитинола и композитов на его основе с поверхностными слоями из титана или тантала на образование H2O2 в фосфатном буфере (pH 6.8) при прогревании (37°C) в течение 200 мин в системе усиленной хемилюми-несценции (люминол—я-иодфенол—пероксида-за), как описано ранее [9, 10]. Как видно из табл. 1, наноструктурный нитинол и композиты на его основе по-разному влияют на образование H2O2. Напыление титана или тантала уменьшает концентрацию образующего пероксида водорода, причем слой из тантала уменьшает концентрацию H2O2 примерно на 60%, тогда как слой из титана — только примерно на 40%.
При использовании специфичного для ОН-радикалов флуоресцентного зонда — кумарин-3-карбоновой кислоты ("Aldrich", США) [11, 12] — установлено, что все варианты барьерных покрытий уменьшают количество таких радикалов, возникающих в растворе 20 мМ фосфатного буфера (pH 6.8) при нагревании (80°C) в течение 2 ч (табл. 1). Покрытия из титана или тантала снижали количество гидроксильных радикалов прибли-
зительно на 70 и 80% соответственно. Используемые нами тест-системы показали, что поверхностные композиционные слои с титаном или танталом в существенной мере предотвращают излишнюю генерацию таких активных форм кислорода, как гидроксильные радикалы и пероксид водорода.
Исследование биосовместимости наноструктурного нитинола и композитов на его основе с поверхностными слоями из титана или тантала проводили с помощью стандартных тест-систем in vitro. В качестве стандартных клеточных моделей использовали культуры миофибробластов периферических сосудов человека и мезенхималь-ных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека. Миофибробласты выделяли из иссеченных периферических вен по методике, описанной ранее [13], и выращивали в среде DMEM ("Биолот", Россия) с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки ("Gibco", США), 40 мкг/мл гентамицина при 37°С и 5% углекислого газа в условиях С02-инкубатора ("Binder", Германия). Мезенхимальные стромальные клетки костного мозга ("Биолот", Россия) выращивали в среде alpha-MEM ("Sigma", США) в тех же условиях.
Фрагменты образцов материалов размером 25 х 25 мм помещали в лунки 6-луночного планшета ("Greiner", Германия) по 1 образцу в лунку. Затем на поверхность образцов материалов высевали клетки с концентрацией 5 • 103 кл/см2. Культивирование клеток на образцах проводили в течение 5 сут. Для определения количества живых и погибших клеток клетки, растущие на поверхности образцов, окрашивали флуоресцентными красителями — акридиновым оранжевым ("Sigma", США), 1 мкг/мл и иодидом пропидия ("Sigma", США), 1 мкг/мл. Акридиновый оранжевый окрашивает живые и погибшие клетки, иодид пропидия окрашивает только погибшие клетки. Затем образцы инкубировали в течение 10 мин при 37°С [14]. Далее проводили микроскопический анализ образцов с использованием флуоресцентного микроскопа DM 6000 ("Leica", Германия). Для анализа подсчитывали не менее 500 клеток на поверхности образца. В случае миофибробластов периферических сосудов число живых клеток для NiTi (контроль), Ta@NiTi, Ti@NiTi составляло 91 ± 3, 95 ± 2 и 97 ± 2% соответственно. В случае культуры МСК число живых клеток для NiTi, Ta@NiTi, Ti@NiTi было равно 95 ± 1, 96 ± 3 и 96 ± ± 2% соответственно. Таким образом, все используемые в работе образцы поверхностей материалов не оказывали краткосрочного токсического действия на клетки, обрастающие эти поверхности de novo.
Для анализа митотической активности клеток был использован митотический индекс клеток, находящихся в логарифмической фазе роста
БИОСОВМЕСТИМОСТЬ НАНОСТРУКТУРНОГО НИТИНОЛА
51
NiTi Ta@NiTi Ti@NiTi
Рис. 1. Влияние нитинола и нитинола с поверхностными композиционными слоями на основе тантала или титана на изменение митотического индекса миофибробластов периферических сосудов человека (столбцы без штриховки) и мезенхимальных стро-мальных клеток костного мозга человека (столбцы со штриховкой).
Здесь и на рис. 2 представлены усредненные данные трех независимых экспериментов. * Отличие относительно группы NiTi достоверно, p < 0.05 (U-критерий Манна—Уитни).
(3-и сут от момента посева), рис. 1. Число клеток, находящихся в состоянии митоза, определяли с помощью флуоресцентной микроскопии, используя прижизненное окрашивание флуоресцентным красителем Hoechst 33342 ("Sigma", США). Митотические клетки выявляли по распределению хроматина, характерному для профазы (P), метафазы (M), анафазы (A) и телофазы (T). Для анализа подсчитывали не менее 500 клеток на поверхности образца. Митотический индекс (MI) вычисляли по формуле MI = (P + M + A + + T )/N ■ 100%, где (P + M + A + T) - количество клеток, находящихся на стадии профазы, метафа-зы, анафазы и телофазы, а N — общее число проанализированных клеток [15]. Индекс MI клеток, растущих на поверхности образца NiTi (контроль), для культуры миофибробластов составлял 3.1%, а для культуры МСК 1.8%. В случае образца Ta@NiTi MI для миофибробластов периферических сосудов был равен 6.1%, для МСК ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.