ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2014, том 64, № 5, с. 551-561
ФИЗИОЛОГИЯ ПОВЕДЕНИЯ; ^^^^^^^^^^^^ ОБУЧЕНИЕ И ПАМЯТЬ
УДК 612.82
БЛОКАДА ДЕАЦЕТИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНОВ В МОЗГЕ МОДУЛИРУЕТ ЭКСПРЕССИЮ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ c-FOS И ZENK И ПОТЕНЦИИРУЕТ ОБРАЗОВАНИЕ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ
У НОВОРОЖДЕННЫХ ЦЫПЛЯТ
© 2014 г. К. А. Торопова1, 2, К. В. Анохин1, 2, А. А. Тиунова2
1Отдел нейронаук Курчатовского НБИКС-центра, НИЦ "Курчатовский институт", Москва, 2Лаборатория нейробиологии памяти, ФГБУ "НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина" РАМН, Москва,
e-mail: aat699@yahoo.com Поступила в редакцию 21.10.2013 г. Принята в печать 19.05.2014 г.
Целью работы было исследование роли ацетилирования гистонов клеток мозга в формировании памяти у новорожденных цыплят. Для этого исследовали, как внутримозговое введение ингибитора гистондеацетилаз трихостатина А влияет на формирование памяти при "слабом" обучении цыплят в задаче пассивного избегания и на экспрессию транскрипционных факторов c-Fos и ZENK. Введение трихостатина А перед обучением приводило к достоверному дозо-зависимому усилению памяти при тестировании через 24 ч. Кроме того, трихостатин А индуцировал экспрессию c-Fos и ZENK в ряде структур мозга: в промежуточном медиальном мез-опаллиуме и гиппокампе увеличивалась плотность клеток, экспрессирующих ZENK, а в промежуточном аркопаллиуме и дорзокаудальном нидопаллиуме — экспрессирующих c-Fos. При этом ни в одной из структур последующее обучение не приводило к дополнительной экспрессии этих генов. Полученные результаты показывают возможность усиления "слабой" памяти у цыплят ингибитором гистондеацетилаз, что поддерживает гипотезу о роли процесса ацетилирования гистонов в консолидации долговременной памяти. Этот эффект может быть связан с активацией экспрессии генов транскрипционных факторов в структурах мозга, вовлеченных в консолидацию памяти в данной модели.
Ключевые слова: обучение, память, ацетилирование гистонов, экспрессия генов.
Inhibition of Histone Deacetylases in the Chick Brain Modulates Expression of c-Fos and ZENK Transcription Factors and Facilitates Establishment of Long-Term Memory
K. A. Toropova1, 2, K. V. Anokhin1, 2, A. A. Tiunova2
1Department of Neuroscience Kurchatov NBICSCenter, NRC "Kurchatov Institute", Moscow, 2Laboratory for Neurobiology of Memory, P.K. Anokhin Institute of Normal Physiology RAMS, Moscow,
e-mail: aat699@yahoo.com
The aim of the work was to examine the role of histone acetylation in memory consolidation in newborn chicks. We studied the effects of histone deacetylase inhibitor trichostatin A (TSA) on a "weak" memory for passive avoidance and on expression of two transcription factors c-Fos and ZENK known to play a role in neuronal plasticity in the chick brain. Intraventricular administration of trichostatin A prior to training produced a dose-dependent enhancement of memory when tested 24 hours after the training. It also increased neuronal expression of c-Fos and ZENK proteins: the density of ZENK immunopositive cells increased in the hippocampus and intermediate medial mesopallium and the density of c-Fos immunopositive cells increased in intermediate arcopallium and dorsocaudal nidopallium. Weak passive avoidance training did not produce further enhancement of c-Fos and ZENK expression in any of these brain areas. These data demonstrate possibility of facilitating long-term memory in day-old chicks by a
histone deacetylases inhibitor, thus supporting the hypothesis on the role of histone acetylation in long-term memory formation. They also suggest that these effects might be mediated through modulation of transcriptional response in brain areas involved in consolidation of this form of memory.
Keywords: learning, memory, gene expression, histone acetylation. DOI: 10.7868/S0044467714050116
Формирование долговременной памяти при приобретении нового опыта инициируется экспрессией в нейронах "немедленных ранних генов", в том числе генов транскрипционных факторов c-Fos и zif268, которые, в свою очередь, запускают изменения в экспрессии "поздних" генов [Анохин, 1997; Gu-zowski et al., 2001] и последующие перестройки синаптических связей [Moorman et al., 2011]. В последние годы накапливаются также свидетельства, что для фиксации этих долговременных перестроек требуются дополнительные эффекты эпигененетических регуляторов, в частности регуляторов ацетилирования гисто-нов [Peixoto, Abel, 2013]. Динамическое взаимодействие процессов ацетилирования/деа-цетилирования определяет транскрипционно активный или неактивный статус хроматина нейронов головного мозга ("гистоновый код" формирования памяти, [Levenson, Swe-att, 2005]). Экспериментально установлено, что уровень ацетилирования гистонов избирательно усиливается на промоторах генов, активирующихся при обучении [Tsankova etal., 2004]. Кроме того, ацетилирование ги-стонов Н3 и Н4 повышается при формировании памяти в ряде моделей обучения, причем в областях мозга, специфически вовлеченных в данный вид обучения [Federman et al., 2009; Kwon et al., 2010; Levenson et al., 2004]. С другой стороны, введение ингибиторов гистон-деацетилаз в такие области при обучении способно потенциировать память, переводя ее в устойчивую долговременную форму [Federman et al., 2009; Kwon et al., 2010; Levenson et al., 2004; Stefanko et al., 2009; Vecsey et al., 2007]. Установлено также, что экспрессия некоторых генов, вовлеченных в формирование долговременной памяти, повышается при введении ингибиторов гистондеацетилаз. В частности, при введении ингибитора гистондеацетилаз трихостатина А в гиппокамп мышей при формировании условнорефлекторного страха, усиление памяти опосредовалось через активацию транскрипционного фактора CREB (cAMP response element-binding protein) [Tsankova et al., 2004]. К генам, регулиру-
емым CREB, относятся в частности гены транскрипционных факторов c-Fos и zif268, экспрессия которых в нервных клетках запускается в ситуациях обучения и критически необходима для формирования долговременной памяти [Анохин, 1997; Guzowski etal., 2001; Moorman et al., 2011; Suge et al., 2010]. На основании этих фактов мы предположили, что ингибиторы гистондеацетилаз могут избирательно усиливать экспрессию генов транскрипционных факторов в областях мозга, вовлеченных в обучение, и таким образом усиливать память. Для проверки этой гипотезы мы исследовали эффекты введения трихостатина А при "слабом" однократном обучении новорожденных цыплят (1) на формирование памяти и (2) на экспрессию в мозге транскрипционных факторов c-Fos и ZENK (аналог zif268 у птиц).
МЕТОДИКА
В работе использовали цыплят-самцов кросса "Птичное" в возрасте 1—3 сут. Опыты проводили в соответствии с требованиями приказа № 267 МЗ РФ (19.06.2003), а также "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, протокол № 1 от 03.09.2005). Животных содержали парами в металлических боксах размером 20 х 25 х 20 см, при температуре 28° C и световом цикле 12 : 12 ч, с постоянным доступом к воде и корму.
Для тестирования влияния ингибиторов гистондеацетилаз на консолидацию памяти цыплят обучали в модели пассивного избегания по "слабому" протоколу [Crowe et al., 1989]. Данное обучение основано на врожденной склонности новорожденных цыплят клевать мелкие объекты. Обучение заключалось в предъявлении каждому животному белой бусины, смоченной жгучим веществом — 10%-ным раствором метилантранилата (Sigma) в этаноле. Цыплята, клюнувшие такую бусину, демонстрировали видоспецифиче-скую аверсивную реакцию и при последую-
щем предъявлении этой бусины избегали ее. За 20 мин до обучения проводили предобуче-ние, в ходе которого каждому животному предъявляли две смоченные водой бусины: сначала белую, на которую впоследствии проводилось обучение, затем металлическую. Через 24 ч после обучения проводили тестирование избегания двух бусин: белой ("авер-сивной") и металлической (нейтральной, служащей дифференцировочным объектом). При тестировании обе бусины были сухими. По результатам тестирования вычисляли процент избегания: отношение количества цыплят, отвергавших аверсивную бусину, к общему числу животных в группе. Избирательная реакция избегания аверсивной бусины оценивалась как наличие долговременной памяти. Из анализа исключали цыплят, не клюнувших при тестировании нейтральную бусину, то есть сформировавших неспецифическую генерализованную реакцию избегания.
Трихостатин А (TSA, Sigma) вводили за 30 мин до обучения билатерально в область боковых желудочков мозга с помощью микрошприца (Hamilton) и пластикового голово-держателя. Трихостатин А растворяли в диме-тилсульфоксиде (ДМСО, 5 мг/мл) и затем доводили до конечной концентрации физиологическим раствором. Дозы TSA составляли 1 мкг (2% ДМСО в растворе), 2 мкг (4% ДМСО) или 10 мкг (25% ДМСО). Цыплятам контрольной группы вводили несущий раствор (25% ДМСО). Объем всех инъекций составлял 5 мкл на полушарие; в каждой группе было по 18 животных.
Экспрессию с-Fos и ZENK в мозге исследовали у следующих групп цыплят: (1) "Пассивный контроль"; (2) "Несущий раствор" ("НР"); (3) "TSA"; (4) "Обучение + НР"; (5) "Обучение + TSA". В каждой группе было по 6 животных. Животных групп 4 и 5 обучали, как описано выше, и за 30 мин до обучения вводили соответственно несущий раствор или трихостатин А (2 мкг). Цыплятам групп "НР" и "TSA" делали соответствующие инъекции одновременно с группами 4 и 5, но не проводили обучение. Животных всех экспериментальных групп декапитировали через 90 мин после введения веществ. Цыплят группы "пассивный контроль" декапитиро-вали после 3.5 ч содержания в изолированных индивидуальных боксах в темноте. Мозг извлекали из черепа и замораживали в парах жидкого азота.
Анализ экспрессии с-Fos и ZENKпроводи-ли в следующих структурах мозга цыплят: промежуточном медиальном мезопаллиуме (IMM), гиппокампе (Hipp), промежуточном арко-паллиуме (Ai) и дорзокаудальном нидопалли-уме (Ndc). Ранее было показано, что эти структуры вовлекаются в обучение цыплят в модели пассивного избеган
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.