УДК 612.822+577.352.5
БЛОКАДА КАНАЛА ГАМКа-РЕЦЕПТОРОВ НИФЛУМОВОЙ КИСЛОТОЙ ПРЕПЯТСТВУЕТ ДИССОЦИАЦИИ АГОНИСТА
© 2012 г. И. Н. Шаронова*, А. Ю. Дворжак
Научный центр неврологии РАМН, отдел исследований мозга, 105064, Москва, пер. Обуха, 5; *электронная почта: sharonova.irina@gmail.com
Поступила в редакцию 30.05.2011 г.
После доработки 12.05.2012 г.
Нифлумовая кислота (НФК), нестероидное противовоспалительное средство, оказывала двухфазное действие на ГАМК-активируемые токи в изолированных клетках Пуркинье мозжечка. В концентрации 3—300 мкМ она потенцировала токи, а в более высоких концентрациях угнетала их. Блокада НФК усиливалась при деполяризации мембраны, что указывает на канальный механизм блокады. Прекращение совместной аппликации ГАМК и высоких концентраций НФК сопровождалось появлением "хвостовых" токов, что позволяет предположить осуществление блокады НФК по механизму последовательного блока, при котором возвращение канала в закрытое состояние после диссоциации агониста происходит через открытое состояние. Аппликация конкурентного блокатора ГАМКА-рецепторов габазина на стадии деактивации токов не приводила к изменению амплитуды и временного хода "хвостовых" токов, в то время как позитивный аллостерический модулятор золпи-дем усиливал их, а неконкурентные блокаторы пикротоксин и пенициллин блокировали. Полученные данные свидетельствуют о том, что агонист не способен диссоциировать от ГАМКА-рецептора во время блокады канальной поры НФК, и ГАМК остается связанной с рецептором в течение всего времени, пока канал открыт. Результаты данного исследования экспериментально подтверждают справедливость предложенной модели последовательного блока, которая предполагает наличие блокированного состояния, в котором места связывания с агонистом заняты ГАМК.
Ключевые слова: ГАМКА-рецепторы; нифлумовая кислота; пэтч-кламп-метод; нейроны крысы.
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) — основной тормозной медиатор в центральной нервной системе. Быстрое торможение осуществляется при активации постсинаптических ГАМК-рецепто-ров А-типа (ГАМКА-рецепторов), сопряженных с хлорным каналом. В центральных тормозных синапсах постсинаптический ответ на везикулярное высвобождение ГАМК длится дольше, чем можно было ожидать на основании низкой аффинности каналов к ГАМК и относительно короткой продолжительности серии открываний канала после однократного связывания агониста. Было высказано предположение, что десенситизированное состояние рецептора препятствует диссоциации агониста, что приводит к возрастанию времени деактивации [1, 2]. Однако прямые доказательства того, что агонист присутствует на рецепторе во время деактивации, получили только благодаря использованию специального подхода, позволившего одновременно наблюдать связывание агониста и открывания канала во время деактивации. Речь идет об использовании протокола "двойного скачка", позволившего апплициро-вать тот или иной препарат только во время деактивации тока [3]. Используя этот подход, авторы
показали, что присутствие конкурентного блока-тора ГАМКА-рецепторов бикукуллина в момент деактивации рецепторов никак не сказывается на временном ходе деактивации, что подтвердило предположение, согласно которому агонист находится на рецепторе в течение всего времени, пока рецептор находится в открытом или десен-ситизированном состоянии [3].
Ранее нами было показано, что диуретик фу-росемид является блокатором открытого ионного канала ГАМКА-рецепторов, экспрессирующихся в клетках Пуркинье мозжечка [4]. Мы обнаружили, что блокада стационарного компонента ГАМК-активируемого тока фуросемидом сопровождается появлением "хвостовых" токов после прекращения действия агониста и блокатора. На основании этого мы предположили, что блокада фуросемидом осуществляется по механизму последовательного блока, при котором возвращение канала в закрытое состояние после диссоциации агониста происходит через открытое состояние, что приводит к появлению "хвостовых" токов. В предложенной модели предполагается, что переход рецептора в блокированное состояние из открытого и обратно осуществляется непо-
средственно, и неявно предполагается, что в блокированном состоянии все места связывания аго-ниста с рецепторами, участвующими в генерации тока, заняты. Недавно мы обнаружили, что эффекты, сходные с эффектами фуросемида, вызывает нифлумовая кислота (НФК), структурно сходная с фуросемидом. В данной работе, используя метод "двойного скачка", мы проверяли предположение о том, что блокированное состояние ГАМКА-рецептора, так же как и открытое или десенситизированое, и появление "хвостовых" токов связано с "запиранием" агониста на рецепторе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на изолированных клетках Пуркинье, выделенных из срезов мозжечка молодых (14—20 дней) крыс с помощью метода вибродиссоциации без предварительной энзиматиче-ской обработки [5]. Срезы головного мозга инкубировали при комнатной температуре в физиологическом растворе следующего состава (в мМ): NaCl - 124; KCl - 3; CaCl2 - 2.0; MgCl2 -1.6; NaH2PO4 - 1.3; NaHCO3 - 26, глюкоза - 14. Раствор насыщали карбогеном (95% O2, 5% CO2). Выделение клеток и регистрацию их активности производили в растворе следующего состава (в мМ): NaCl - 145; KCl - 3; CaCl2 - 2.4; MgCl2 - 2; HEPES - 10. Микропипетки, изготовленные из боросиликатного стекла, заполняли раствором следующего состава (в мМ): CsCl - 100; CsF - 40; Na2ATP - 2; MgCl2 - 2; EGTA - 5; HEPES - 10. Использовали микропипетки, имеющие сопротивление 2-3 МОм. Эксперименты проводили при комнатной температуре (22-25°C). Токи, активируемые ГАМК, регистрировали с помощью пэтч-кламп-метода в конфигурации "целая клетка". Вещества подводили с использованием системы для быстрой аппликации, описанной ранее [6]. Скорость смены раствора у кончика пипетки оценивали по скорости изменения тока, компенсирующего контактную разность потенциалов, которая возникает при пропускании через открытый кончик пипетки раствора для регистрации, разведенного в 10 раз. Постоянная времени развития этого тока составляла 4.5 ± 0.1 мс (n = 20). Замена раствора у регистрируемого нейрона происходила медленней, чем через открытый кончик пипетки, и время смены раствора было в пределах 20 мс.
Концентрационная зависимость для токов, активируемых ГАМК, описывалась логистическим уравнением:
А = 1/ (1 + (СДГАМК])*),
(1)
где А = /А//А (3Ш мкМ) — относительный ответ, вызываемый ГАМК; ЕС50 — концентрация ГАМК, вызвавшая полумаксимальный ответ; к — коэффициент Хилла. Зависимость эффектов НФК от концентрации имела колоколообразный характер, поэтому для количественной оценки влия-
ния НФК на токи, активируемые ГАМК в постоянной концентрации, использовали модифицированное уравнение Хилла:
= B ■
1 +
EC [НФК]
B ([ НФК]) =
\ (
__1
B
1
1+
[ НФК] IC
(2)
где [НФК] — концентрация НФК, ЕС/1С — концентрации НФК, которые вызывают 50% потен-циацию/блок по отношению к максимальному ответу, кх/к2 — коэффициенты Хилла для потен-циации/блока, В — максимально возможная величина потенциации. Ответы нормировали по амплитуде тока, вызываемого в отсутствие НФК. Количественные данные представлены в виде среднего ± стандартные ошибки среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех исследованных нейронах (представлены данные, полученные при регистрации активности 32 нейронов) аппликация ГАМК в концентрации от 1 до 300 мкМ при поддерживаемом потенциале —70 мВ вызывала входящий ток, амплитуда которого возрастала при увеличении концентрации агониста. Полумаксимальная эффективная концентрация для активации ГАМКа-рецепторов составляла 4.3 ± 0.4 мкМ (п = 9).
Действие НФК на ГАМК-активируемые токи изучали при совместной аппликации 2 мкМ ГАМК (около ЕС20) и НФК в диапазоне концентраций 3—3000 мкМ. Аппликация НФК в отсутствие ГАМК не приводила к активации токов через клеточную мембрану в указанном диапазоне концентраций. Амплитуды токов, вызываемых совместной аппликацией ГАМК и НФК, относили к амплитуде тока, вызываемого 2 мкМ ГАМК. Зависимость эффектов НФК от концентрации аппроксимировали модифицированным уравнением Хилла (2). Обнаружили, что зависимость эффектов НФК от концентрации имеет колоколообразный характер (рис. 1а,б). В концентрации 3—300 мкМ НФК вызывала увеличение амплитуды ГАМК-вызванных токов (потенциацию) по сравнению с контрольными ответами. Максимальная потенциация (от 50 до 600% в разных нейронах, в среднем 507 ± 132%; п = 5) достигалась при концентрации НФК около 300 мкМ. Величина ЕС50 для потенцирующего эффекта НФК составляла 68.8 ± 5.3 мкМ, коэффициент Хилла (к1) 0.74 ± 0.04 (п = 5). При более высоких концентрациях НФК величина потенциации уменьшалась и сменялась блоком (рис. 1а,б). Полумаксимальная блокирующая концентрация НФК (1С50) составляла 1974 ± 50 мкМ, коэффициент Хилла (к2) 1.76 ± 0.05 (п = 5).
а б
НФК(мкМ) + 2 мкМ ГАМК
0.5 с
Рис. 1. Зависимость влияния нифлумовой кислоты (НФК) на ГАМК-активируемые токи от концентрации модулятора. а — Записи токов, регистрируемых в изолированной клетке Пуркинье, в ответ на аппликацию 2 мкМ ГАМК и ГАМК вместе с НФК в возрастающих концентрациях. Поддерживаемый потенциал —70 мВ. Момент аппликации препаратов показан чертой над записями токов. Концентрации НФК указаны слева от кривых. б — Кривая зависимости эффектов НФК от концентрации. Усреднение по пяти нейронам.
Помимо влияния на амплитуду стационарного компонента ответа, НФК заметно изменяла кинетику деактивации токов, вызываемых ГАМК. Как видно из записей токов, представленных на рис. 1а, после окончания совместной аппликации ГАМК и НФК время спада тока заметно возрастало, и этот эффект был выражен тем сильнее, чем выше были концентрации НФК, и не зависел от степени блокады стационарного компонента ответа. При совместной аппликации 2 мкМ ГАМК и 100 мкМ НФК время деактивации (xoff) увеличивалось в 1.91 ± 0.17 раза, а при концентрации 1000 мкМ - в 2.35 ± 0.2 раза (n = 8).
При концентрации НФК > 1 мМ после прекращения совместной аппликации ГАМК и НФК наблюдали кратковременное повышение амплитуды входящего тока — так называемый "хвостовой" ток (рис. 1а, 2а), на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.