БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, с.802-809
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК.577.3
«БЛОКИPОВАНИЕ» ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ ОДИНОЧНЫХ ЛИПИДНЫХ ПОР, ВОЗНИКАЮЩИХ В НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ ПРИ ФАЗОВЫХ ПЕРЕХОДАХ
© 2008 г. В.Ф. Антонов, Е.Ю. Смирнова, А.А. Аносов, В.П. Норик, О.Ю. Немченко
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва, Трубецкаяул., 8-1
E.mail: h.smirnova@gmail.com Поступила в p едакцию 27.12.07 г.
После доработки 19.05.08 г.
И сследовано изменение ионной проводимости бислойных липидных мембран из дипальмито-илфосфатидилхолина при температурах фазового перехода в растворе LiCl (1 М) при добавлении полиэтиленгликоля с различной молекулярной массой. Перевод ионных мембранных каналов из пр оводящего со стояния в блокир ованное (непроводящее) с помощью полимер ов позволяет провести калибр овку липидных пор. Показано, что добавление низкомолекуляр ных глицерина, ПЭГ-300 и ПЭГ-600 вызывает снижение амплитуды флуктуаций тока через мембрану, пропор циональное размеру молекулы встраивающегося полимер а. Добавление ПЭГ-1450, ПэГ-2000, ПЭГ-3350 приводит к снижению флуктуаций тока до уровня базового шума. Этот р езультат рассматривается как полная блокада пр оводимости ионного канала. В пр исутствии достаточно больших полимеров, таких как ПЭГ-6000 и ПЭГ-20000, практически не встраивающихся в пору, вновь обнаруживаются одиночные флуктуации тока, но с несколько меньшими амплитудами, чем в отсутствие полиэтиленгликоля. Предполагается, что полное блокирование проводимости липидных ионных каналов молекулами ПЭГ-1450, ПЭГ-2000 и ПЭГ-3350 обусловлено дегидр атацией пр о света пор ы и превращением гидрофильной пор ы в гидрофобную.
Ключевые слова: фазовый переход, проницаемость, бислойная липидная мембрана, полиэтилен-гликоль.
Водор астворимые молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ) широко используются в биофизике мембран для изучения структуры и функционального состояния белковых ионных каналов: аламетицина [1], а-токсина [2], поринов [3]. Полимеры, имеющие достаточно большие молекулярные массы, которые не проникают в канал, используются для оценки изменения объема каналов [4], а также для определения сопротивления доступа и диаметра каналов [5]. Недавно мы попытались использовать ПЭГ с различными молекулярными массами для оценки размеров липидных пор, возникающих при фазовом переходе в плоском бислое [6], и обнаружили, что добавление полимеров с молекулярными массами от 1450 до 3350 приводит к полному исчезновению флуктуаций тока. В настоящей работе приводится более детальный анализ механизма такого блокирования пор.
Сокращения: ПЭГ - полиэтиленгликоль, БЛМ - бислой-ные липидные мембраны, ДПФХ - 1,2-дипальмитоил-^п-глицеро-3-фосфохолин.
Преимуществом липидных пор в такого рода модельном исследовании по сравнению с реконструированными белковыми порами является возможность контролируемого изменения химического со става стенок поры путем подбора соответствующего липида для формирования бислойных липидных мембран (БЛМ), варьир ование ионного состава ср еды и размеров молекул ПЭГ в широком диапазоне. Изменение проводимости липидных пор в присутствии ПЭГ с различными молекулярными массами, наблюдаемое в нашем исследовании, имеет некоторое сходство с соответствующими изменениями проводимости белковых пор (см. [7]). Это уменьшение проводимости пор (частичное блокирование) при добавлении низкомолекулярных ПЭГ (до ПЭГ-1450), эффект полного «блокирования» молекулами ПЭГ большего размера (до ПЭГ-3350) и, наконец, исключение молекул ПЭГ из пр освета поры (ПЭГ-6000 и ПЭГ-20000). Указанное сходство имеет фундаментальный характер, свидетельствуя об общности биофизических закономерностей ме-
ханизма блокирования проводимости в белковых и чисто липидных порах клеточных мембран. Следует иметь в виду, что чисто липидные поры играют, по-видимому, более существенную роль в физиологии и биотехнологии живой клетки, чем это предполагалось ранее [8-10]. О фундаментальном сходстве механизмов блокирования ионных наноканалов, независимо от их происхождения, свидетельствуют также данные по блокированию молекулами ПЭГ ионных нанопор в лавсановых пленках [11].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изготовления плоских бислойных липидных мембран использовали 1,2-дипальмито-ил-5«-глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), (Avanti Polar Lipids, Alabaster). В качестве омывающего раствора электролита использовали водный раствор 1 М LiCl (рН 6,9). В раствор добавляли глицерин и полимеры ПЭГ-300, ПЭГ-600, ПЭГ-1450, ПЭГ-2000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-20000 (Sigma).
БЛМ формировали по методу [12] на отверстии в стенке тефлонового стаканчика площадью 1 мм2. Мембранофор мирующий раствор содержал 25 мг ДПФХ в смеси декан-хлороформ-метанол (7:2:1 по объему).
Трансмембранный ток регистрировали с помощью пары Ag-AgCl, помещенных в раствор электролита по обе стороны мембраны в режиме фиксации напряжения, равного 50 мВ, с помощью прибора для измерения малых токов (Пущино, Ро ссия). Флуктуации тока записывали с помощью аналого-цифрового преобразователя (частота дискретизации 10 Гц). Детали измерений описаны ранее [6].
В соответствии со схемой опыта плоские БЛМ формировались при температуре 50°С (выше температур ы фазового перехода ДПФХ), после чего температура в кювете снижалась со скоростью 0,5°С в минуту. Регистрировали флуктуации тока, которые возникали в узком температурном диапазоне в области основного фазового перехода примерно в течение 150 с. Кроме того, в присутствии блокирующей группы ПЭГ проводили контрольные записи в режиме тер мостатир ования при температур е 43,5°С в течение 20 - 25 мин. БЛМ формировали в растворе 1 М LiCl, содержащем 20% соответствующего ПЭГ (по весу). Измерения проводили в симметричных условиях.
Температур у фазового пер ехода ДПФХ в суспензии многослойных липосом измеряли с помощью дифференциального сканир ующего калориметра ДАСМ-4 (Пущино, Россия). Для измерения термограмм в присутствии ПЭГ, следуя методике, описанной в работе [13], раствор
ПЭГ соответствующей концентрации добавляли в суспензию многослойных липосом в 1 М растворе ЫС1. Готовый раствор нагревали и встряхивали.
Удельную пр оводимость 1 М ЫС1 раствора пр и добавлении ПЭГ с различными молекулярными массами измеряли на постоянном токе в электролитической ячейке с двумя плоскими Р1>электродами площадью 1 см2 каждый при комнатной температур е.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Флуктуации тока в бислойных липидных мембранах при фазовом переходе. Данные, представленные на рис. 1, получены в опытах с БЛМ из ДПФХ, сформированных в 1 М водном растворе ЫС1 без добавления ПЭГ (контр оль) и при добавлении ПЭГ возрастающей молекулярной массы. Экспериментальные записи можно разделить на тр и группы: 1) для глицерина, ПЭГ-300, ПЭГ-600 - уменьшение амплитуды флуктуаций тока с увеличением молекулярной массы ПЭГ; 2) - для ПЭГ-1450 - ПЭГ 3350 -полное отсутствие флуктуаций тока; 3) - появление флуктуаций тока с амплитудой, близкой к контролю, в растворах высокомолекулярных ПЭГ-6000, ПЭГ-20000. Проводимость омывающего раствора уменьшалась с увеличением молекулярной массы полимера вплоть до ПЭГ-1450, после чего пр актически не менялась. Можно видеть, что добавление ПЭГ-300 и ПЭГ-600 сопровождается снижением амплитуды одиночных флуктуаций тока пр опорционально размеру молекул встраивающегося в пор у полимер а. К аналогичному эффекту приводит добавление глицерина, который в соответствии с его молекулярной массой занимает место между контр олем и ПЭГ-300. П ри добавлении полимер ов втор ой группы - ПЭГ-1450, ПЭГ-2000 и ПЭГ-3350 - отдельные флуктуации тока не наблюдаются в течение всего периода исследований, интегральная проводимость мембраны снижается до ур овня шума. Следует отметить ур еже-ние флуктуаций в присутствии ПЭГ-6000, которое можно связать с действием осмотического давления, вызванного непроникающими в пору ПЭГ и пр епятствующего образованию поры [4]. Можно было бы предположить, что «блокирующий» ПЭГ-3350 также не проникает в пору и, создавая большее, чем ПЭГ-6000 осмотическое давление, способствует урежению импульсов вплоть до полного их исчезновения. Однако для ПЭГ 20% (по весу) концентрации и достаточно больших молекулярных масс (более 3000) осмотическое давление слабо зависит от их молекулярной массы [14] и не должно вызвать
I
1.5 нА
2с
Контроль
•шГиЦ!
ШЙ
Глицерин
пэг-зоо
ПЭГ-600 ПЭГ-1450
ПЭГ-2000
ПЭГ-3350
Л
ПЭГ-6000 ПЭГ-20000
Рис. 1. Флуктуации тока в БЛМ из ДПФХ в 1 М ЫС1 при добавлении глицерина и ПЭГ с различными молекулярными массами. Плоские БЛМ формировали в растворе 1 М ЫС1, содержащем 20% соответствующего ПЭГ (по весу) при температуре 50°С (выше температуры фазового перехода ДПФХ), после чего температура в кювете снижалась со скоростью 0,5°С в минуту. Записывали флуктуации тока, возникающие в области температуры основного фазового перехода. Измерения проводили в симметричных условиях.
значительного урежения флуктуаций тока в присутствии ПЭГ-3350 по сравнению с ПЭГ-6000. Таким образом, значительно большая длительность записи (примерно 150 с в режиме сканирования по температуре и до 20 мин в режиме термостатирования) в присутствии ПЭГ-3350 по сравнению с средней длительностью межимпульсных интервалов в присут ствии ПЭГ-6000 (как показано на рис. 1 - пример но 18 с) исключает возможность подобного объяснения отсутствия флуктуаций в присутствии ПЭГ-3350. Будем поэтому называть группу ПЭГ-1450 - ПЭГ-3350 «блокирующей группой». Данные о проводимости пор, а также об удельной проводимости омывающего раствора 1 М ЫС1 при добавлении ПЭГ с различными молекулярными массами приведены в таблице.
Калориметрические измерения. Поскольку, как было установлено ранее [6], флуктуации тока в БЛМ наблюдаются в достаточно узком диапазоне вблизи температуры фазового перехода, можно предположить, что причиной исчезновения флуктуаций тока является смещение температуры фазового перехода под влиянием
достаточно концентрированных растворов ЫС1 (1 М) или ПЭГ. На рис. 2 приведена термограмма многослойных липосом из ДПФХ в ра створ е 1 М К С1 с предпереходом при 35,5°С и основным переходом при 41,5°С (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.