научная статья по теме БЛОКИРОВАНИЕ ДИГИДРОПИРИДИНОВЫХ КАНАЛОВ ПРЕПЯТСТВУЕТ УВЕЛИЧЕНИЮ УРОВНЯ АКТИВИРОВАННОГО -КАЛЬПАИНА ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКЕ M. SOLEUS Математика

Текст научной статьи на тему «БЛОКИРОВАНИЕ ДИГИДРОПИРИДИНОВЫХ КАНАЛОВ ПРЕПЯТСТВУЕТ УВЕЛИЧЕНИЮ УРОВНЯ АКТИВИРОВАННОГО -КАЛЬПАИНА ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКЕ M. SOLEUS»

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

577.1

БЛОКИРОВАНИЕ ДИГИДРОПИРИДИНОВЫХ КАНАЛОВ ПРЕПЯТСТВУЕТ УВЕЛИЧЕНИЮ УРОВНЯ АКТИВИРОВАННОГО ц-КАЛЬПАИНА ПРИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РАЗГРУЗКЕ M. SOLEUS

© 2015 г. С. П. Белова, Ю. Н. Ломоносова, Б. С. Шенкман, Т. Л. Немировская

Представлено академиком РАН И.Б. Ушаковым 23.04.2014 г. Поступило 25.08.2014 г.

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 460, № 1, с. 98-101

УДК

Б01: 10.7868/80869565215010247

При гипокинезии и гравитационной разгрузке белки цитоскелета и сократительные белки скелетных мышц подвергаются деструкции. Мало исследованы механизмы этого процесса. При функциональной разгрузке мышц существенный вклад в развитие процессов атрофии вносят каль-паиновая и убиквитин-протеасомная системы. Ранее обнаружено, что Е3-лигаза МиЯР-1 участвует в убиквитинировании толстых филаментов при атрофии [1]. Как может приступить к работе убик-витин-протеасомная система, если толстые фила-менты защищены от убиквитирования в миофиб-риллах связанными белками? Мы полагаем, что доступность толстых филаментов для убиквитирования с помощью ЕЗ-лигаз может обеспечить кальпаиновая система.

Кальпаины являются кальцийзависимыми не-лизосомальными протеазами. Ранее было обнаружено, что при функциональной разгрузке в мышце резко увеличивается концентрация кальция [2, 3] и остается на этом уровне длительное время, что может приводить к активации кальпа-инов. Кальпаины становятся протеолитически активными только при аутолизе, который происходит при повышенной концентрации кальция в среде [4]. Кальпаин 1 (^-кальпаин) регулируется микромолярными концентрациями кальция, тогда как для активации кальпаина 2 необходимы его миллимолярные концентрации. Причем это повышение может быть незначительным, но должно держаться в течение длительного времени. Можно предположить, что кальпаины могут служить начальным звеном, приводящим к до-

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Институт медико-биологических проблем Российской Академии наук, Москва

ступности для убиквитинирования миофибрил-лярных белков при функциональной разгрузке мышц. Целью работы было выявление роли ди-гидропиридиновых рецепторов в протеолизе некоторых белков т. 8о1еш, подвергающихся деструкции на ранних этапах функциональной разгрузки, и выявление протеолитических систем, которые могут запускать этот процесс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Крысы популяции Щ81аг (21 самец) были случайным образом распределены на 3 группы по 7 крыс в каждой: интактный контроль (группа "К", масса крыс — 197 ± 4 г), 3-суточное вывешивание (группа "В", масса 209 ± 6 г), третью группу вывешивали с введением нифедипина (группа "ВН", масса 201 ± 7 г). Препарат, растворенный в 1% ЭМ80, вводили внутрибрюшинно в дозе 7 мг/кг дважды в день. Крысам групп "К" и "В" вводили 1% ЭМСО в физиологическом растворе. Затем крыс наркотизировали нембуталом (75 мг/кг), препарировали и выделяли камбаловидные мышцы, которые немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при —85° С. Масса выделенных т. 8о1еш в контроле составила 73.3 ± 4 мг, в группе "В" - 73.7 ± 5 мг и в группе "ВН" - 73.5 ± 4 мг соответственно. Методом электрофореза в поли-акриламидном геле определяли содержание тяжелых цепей миозина (ТЦМ). Из каждой пробы т. 8о1еиз были получены срезы (10-15 мг), которые немедленно гомогенизировали в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС1-буфера (рН 8.0), 150 мМ ШС1, 0.1% ДДС-Ш, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ Р-глицерофосфата, 0.5 мМ дитиотреитола, 5 мМ ЭГТА, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл леупепти-на, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 50 мМ 1 мМ Ма3У04, 10 мкг/мл пепстатина, 0.1% Тритона Х-100. Образцы нормировали по уровню

БЛОКИРОВАНИЕ ДИГИДРОПИРИДИНОВЫХ КАНАЛОВ

99

Содержание десмина, % контроля 120

100 80 60 40 20

0

"К"

'В"

"BH"

Рис. 1. Изменение относительного содержания десмина (М± т) в т. 8о1еш у вывешенных ("В") и вывешенных с введением нифедипина ("ВН") крыс. Здесь и на рис. 2 * — р < 0.05 по сравнению с контролем ("К").

GAPDH, содержащегося в каждой пробе. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану производили в буфере: 25 мМ Трис (pH 8.30), 192 мМ глицин, 20% метанол, 0.04% ДДС-Na. Далее для определения ц-кальпаина использовали следующие антитела: анти-calpain-l ("Cell Signaling Technology", США, № 2556, разведение 1 : 900), анти-pAkt ("Cell Signaling Technology", 1 : 800), Akt ("Cell Signaling Technology", 1 : 1000), анти-MuRFl ("Santa Cruz Biotechnology", США, 1 : 2000), анти-desmin ("Santa Cruz Biotechnology", 1 : 800) - первичные антитела, GAM ("Bio-Rad", США, 1 : 50000) и GAR ("Santa Cruz Biotechnology", 1 : 1000) — вторичные антитела. Данный набор антител позволяет определить содержание аутолизированного или активированного ц-каль-паина. Они детектируют как полноразмерную молекулу кальпаина 1, так и аутолитически расщепленную молекулу в положении 28 лейцина. В этом случае на дорожке фореграммы отчетливо видны

две полосы. Анализ белковых полос производили с помощью денситометра GS-800 ("Bio-Rad").

Для анализа экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени определяли уровень мРНК ц-кальпаина, тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа, ТЦМ IIa, ТЦМ IId/x, ТЦМ IIb и ЕЗ-лигаз (атрогена-1 и MuRFl). Тотальную РНК выделяли из 10 мг m. soleus при помощи RNeasy Micro Kit ("QIAGEN", Германия). Все образцы РНК были обработаны протеиназой K и ДНКазой I. Для обратной транскрипции использовали водный раствор 1 мкг РНК, олиго^Т)15, гексануклеотиды d(N)6, обратную транскриптазу MMLV. Обратную транскрипцию проводили при 37°С в течение 60 мин согласно стандартному протоколу. Полученные образцы кДНК хранили при —84°С для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I. Для анализа полученных данных с помощью ОТ-ПЦР применяли метод Ливака. В качестве референсного гена с помощью базы EST Database был выбран RPL19. Был проведен статистический однофакторный анализ ANOVA. Достоверность различий между группами определяли по непарному i-критерию Стьюдента, достоверными считали различия приp < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Вес m. soleus и состояние цито-скелета. Вес камбало видных мышц не различался между группами (как целой мышцы, так и ее сухого веса). Содержание цитоскелетного белка де-смина в m. soleus относительно контроля после трех дней вывешивания снизилось на 27% (p < 0.05) только в группе "В". В группе "ВН" разрушения десмина не наблюдали (рис. 1). Содержание белка ТЦМ не различалось между группами.

Компоненты внутриклеточных протеолитических сигнальных си-

Содержание кальпаина, % контроля 250

200 150 100 50 0

(а)

#

Уровень экспрессии относительно контроля (в разах) 4 г

"К"

"В"

BH"

-

BH"

Рис. 2. Содержание (М ± т, п = 7 в каждой группе) белка (а) и мРНК (б) ц-кальпаинов в камбаловидной мышце у вывешенных ("В") и вывешенных с введением нифедипина ("ВН") крыс. # — достоверные отличия от "В" (р < 0.05).

3

2

100

БЕЛОВА и др.

с т е м. Одновременно с разрушением десмина в группе "В" мы обнаружили увеличение содержания аутолизированного ц-кальпаина. Оно было на 94% выше, чем у контрольных животных (p < 0.05, рис. 2а). Блокирование дигидропиридиновых каналов в группе "ВН" предотвратило это изменение. В то же время экспрессия гена ц-кальпаина в группах "В" и "ВН" повысилась по сравнению с контролем на 70 и 95% соответственно (p < 0.05, рис. 2б). Экспрессия ЕЗ-лигаз MAFbx в обеих группах с вывешиванием животных повысилась на 210% (p < 0.05), а уровень MuRF-1 (как белка, так и мРНК) вдвое превышал таковой в контроле (p < 0.05). Уровень pAkt в группах "В" и "ВН" был ниже контрольного уровня на 49 и 46% соответственно (p < 0.05). Тотальный уровень Akt не различался между крысами подопытных и контрольных групп.

Миозиновый фенотип. Уровень мРНК ТЦМ I и IIa типов после трех дней вывешивания (группы "В" и "ВН") не отличался от контрольных показателей. В то же время содержание мРНК ТЦМ изоформ IIb и IId/x в этих группах превышало контроль в 8 и 6 раз соответственно (p < 0.05).

В предыдущих исследованиях мы показали, что концентрация кальция увеличивается в 4 раза после первых трех суток вывешивания крыс [3]. Однако при двухнедельном блокировании нифе-дипином кальциевых каналов L-типа повышение концентрации кальция в мышечных волокнах при разгрузке и атрофия мышц частично предотвращались [5]. За 3 дня вывешивания крыс мы не обнаружили снижения массы m. soleus и содержания белка ТЦМ. В то же время уровень десмина в группе "В" существенно снизился, а в группе "ВН" он не отличался от группы контроля. Мы не видим в этих результатах противоречия с данными при определении массы камбаловидной мышцы, так как снижение количества цитоскелетного белка не обязательно должно отразиться на массе целой мышцы. В работе [6] обнаружено, что показатели динамики изменения массы мышцы и тотального содержания белка, а также отдельных белков могут не совпадать. Мы предположили, что блокирование L-каналов у животных группы "ВН" может предотвратить повышение у них уровня аутолизированного ц-кальпаина. Известно, что для проявления функции кальпаина как протеазы необходим аутолиз этого белка [7]. Ранее отмечалась взаимосвязь между увеличением уровня ионов кальция в мышце, повышением содержания ц-кальпаина и разрушением десмина [8]. Кальпаины инициируют протеолиз цитоскелет-ных белков и чувствительны даже к сверхнизким концентрациям кальция [9, 10]. Разрушению десмина в soleus крыс группы "В", вероятно, способствуют увеличение содержания ионов кальция при разгрузке [3] и повышение содержания аутолизи-

рованного ц-кальпаина. Действительно, в группе "ВН" содержание аутолизированного ц-кальпаи-на не отличалось от такового группы "К", в то время как в группе "В" оно было выше на 94%. Интересно, что экспрессия гена ц-кальпаина была существенно увеличена в обеих группах с вывешиванием. По-видимому, экспрессия гена (в отличие от активности белка кальпаина) не регулируется уровнем кальция в цитоплазме. Однако известно, что протеолитическая активность каль-паина in vivo регулируется кальцийзависимыми механизмами посттранскрипционно.

Таким образом, десмин в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком