УДК 577.123
БЛОКИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ микроРНК miR-221, -30d И -15a СПОСОБСТВУЕТ РАЗВИТИЮ РАКА ПРОСТАТЫ ПРИ ПОСРЕДСТВЕ
БЕЛКА BMI1*
© 2015 Хенкванг Ксуан, Вей Ксуе**, Джяхуа Пен, Джяджун Ше, Бейджун Донг, Юран Хуанг
Department of Urology, Renji Hospital, Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine, Shanghai, China; fax: +86(21)683-83716, E-mail: weixuerh@sohu.com
Поступила в редакцию 20.05.14 После доработки 03.08.14
Злокачественная опухоль простаты (PCa) — это тип рака, находящегося на втором месте по смертности среди мужчин. В патогенез рака простаты вовлечен белок BMI1, член протеинового семейства PcG. Было обнаружено, что злокачественное перерождение тканей простаты сопровождается нарушением экспрессии некоторых микроРНК (miPHK). Пока неясно, как miPHK регулируют экспрессию BMI1. Используя двойную люциферазную тест-систему, мы провели селекцию 18 miPHK, обладающих потенциальной способностью подавлять экспрессию белка BMI1, и обнаружили, что 12 из них были способны связываться с З'-концевым нетранслируемым районом (3'-НТР) в мРНК BMI1. Методом ПЦР в режиме реального времени было установлено, что в злокачественных тканях простаты сильно снижены уровни экспрессии эндогенных miR-221, -15a и -30d. Последующие функциональные исследования показали, что miR-221 и miR-30d могут ингибировать пролиферацию злокачественных клеток простаты, а дополнительная экспрессия в них белка BMI1 может частично снимать супрессорное воздействие этих микроРНК на клеточную пролиферацию. В своем исследовании мы выявили взаимосвязь между снижением уровней экспрессии miR-221, -30d и развитием патологического процесса при раке простаты. Полученные нами результаты показали, что микроРНК miR-221 и miR-30d являются потенциальными супрессорами злокачественной опухоли простаты и могут служить в качестве маркеров для оценки степени тяжести этого вида рака, а также могут являться мишенями для терапевтического воздействия при лечении этого онкологического заболевания у человека.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: miPHK, рак простаты, BMI1, клеточная пролиферация.
Рак простаты (РСа) — второй по смертности среди мужчин тип рака, является комплексным многофакторным заболеванием, определяющимся как генетическими предпосылками, так и воздействием различных факторов окружающей среды. Несмотря на тяжесть клинических и социальных последствий этого заболевания, механизмы, лежащие в его основе, остаются недостаточно понятными.
Принятые сокращения: PCa — рак простаты; miPHK — микроРНК; siPHK — малые интерферирующие РНК; BMI1 — B-cell specific Molony leukemia virus insertion region homolog 1, онкобелок из семейства PcG (polycomb group); 3'-НТР — 3'-концевой нетранслируемый район мРНК; AGO2 — главный белковый компонент комплекса RISC; GAPDH — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-144, 25.01.2015.
** Адресат для корреспонденции.
К настоящему времени стало известно, что белки семейства PcG (polycomb group), которые были впервые идентифицированы у Drosophila как эпигенетические регуляторы генов гематопо-эза, играют ключевую роль в прогрессии и реци-дивировании рака [1]. Известно также, что повышенная экспрессия белка BMI1 (B-cell specific Molony leukemia virus insertion region homolog 1) — члена семейства PcG, используемого в качестве маркера в биологии стволовых клеток, коррелирует с устойчивостью клеток к химическому стрессу [2]. Проведенные недавно исследования показали, что между уровнем экспрессии BMI1 и прогрессией рака простаты наблюдается прямая положительная корреляция [3, 4]. Сообщалось также о том, что BMI1 является важнейшим регулятором самообновления стволовых клеток простаты и их перерождения в злокачественные [5].
МикроРНК (miPHK) — это один из видов коротких некодирующих РНК, подавляющих
339
3*
экспрессию белков путем частично комплементарного связывания с З'-концевым нетрансли-руемым районом (З'-НТР) в мРНК. Согласно биоинформационным предсказаниям, экспрессия более 60% белок-кодирующих генов регулируется при участии miPHK. Изменения уровней экспрессии miPHK влияют на процессы возникновения, развития и метастазирования раковых опухолей человека и, как предполагается, на функционирование онкогенов и опухолевых супрессоров в злокачественной ткани [6, 7]. Сообщалось также, что нарушения экспрессии некоторых miPHK сопровождают развитие патологического процесса при раке простаты [8—10].
Для проведения своей работы мы сконструировали на основе люциферазы З'-НТР BMIl-ре-портерную систему и провели скрининг 18 miPHK, которые потенциально были способны подавлять экспрессию BMI1. Мы изучили эндогенную экспрессию в злокачественных тканях простаты 12 miPHK, отобранных в результате скрининга, и обнаружили, что уровни экспрессии некоторых из них (miR-221, -30d и -15a) были существенно снижены по сравнению с нормой. Полученные нами результаты способствуют прояснению взаимоотношений между miPHK и развитием рака простаты. Кроме того, мы предложили к использованию потенциальные биомаркеры для клинической диагностики рака простаты и возможные мишени для терапевтического воздействия при лечении PCa.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы тканей. Забор образцов тканей проводили у пациентов возраста 65—75 лет, подвергнутых биопсии в Госпитале Ренджи с мая 2011 г. по ноябрь 2013 г. Была сделана случайная выборка 30 биоптатов раковой ткани и соответствующих им образцов соседних нормальных тканей простаты больных пациентов для изучения экспрессии BMI1 и miPHK.
Культура клеток. Елетки PC-3 были выращены в среде RPMI 1640 с добавкой фетальной сыворотки и 2 мМ глютамина («Hyclone», США) в атмосфере 5%-ного СО2 при 37°. ¿летки HEK293T культивировали в тех же условиях в среде Дуль-бекко, содержавшей 10%-ную фетальную сыворотку («Hyclone», США), 100 мкг/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. Синтетические микроPHK miR-221 и miR-30d, а также малые интерферирующие Л002-специфичные siPHK (AG02 siPHK) были получены от фирмы «Shanghai GenePharma» (Хитай).
Вестерн-блоттинг. Белковые экстракты тканей нагревали в буфере для образцов, содержавшем
Ds-Na и ß-меркаптоэтанол, и наносили на 12%-ный ПААГ по 20 мкл в лунку. После проведения электрофореза белки переносили на PVDF-мембраны («Amersham Pharmacia Biotech», Англия). Мембраны блокировали, а затем инкубировали с поликлональными кроличьими анти-BMIl антителами («Abcam», США) и моноклональными анти-GAPDH антителами («Santa Cruz Biotechnology Inc.», США) в течение ночи при 4°. Комплексы антиген—антитело выявляли с помощью конъюгатов пероксидазы с вторичными антикроличьими или с антимышиными IgG методом электрохемилюминес-ценции с использованием набора для ECL («Pierce», США). GAPDH была использована в качестве внутреннего контроля.
ПЦР в режиме реального времени был использован для полуколичественной оценки уровней экспрессии 12 выбранных miPHK. Фракцию общей РНК экстрагировали из тканей с использованием реагента Trizol Reagent («Invitrogen», США) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Обратную транскрипцию и получение кДНК проводили с использованием набора TaqMan Micro-RNA Reverse Transcription Kit и miRNA-specific TaqMan MGB Probes («Applied Biosystems», США). В качестве внутреннего контроля для нормирования данных была использована U6 snPHK (не-кодирующая малая ядерная РНК). Каждое определение проводили в трех повторах и представляли результаты как средние значения ± s.d.
Двойной люциферазный тест. Полноразмерный 3'-НТР гена BMI1 (1948 п.н.) клонировали в вектор pmirGLO («Promega», США), содержавший кодирующий район гена люциферазы светлячков, с целью получить люциферазный ре-портерный вектор, в котором 3'-НТР расположен вслед за геном люциферазы. Для проведения люциферазного репортерного теста клетки HEK293T высевали в 48-луночные планшеты и трансфицировали их синтетическими miR-221 или miR-30d одновременно с люциферазным репор-терным вектором с использованием липофекта-мина 2000 («Invitrogen», США). Спустя двое суток клетки собирали и анализировали в двойном люциферазном тесте Dual-Luciferase Assay («Pro-mega», США). Каждый эксперимент выполняли в трех независимых повторах и представляли результаты как относительную люциферазную активность (отношение активности люциферазы светлячков к активности люциферазы коралла Renilla).
Тест на клеточную пролиферацию. Клетки PC-3 высевали в 96-луночные планшеты (2 х 103 клеток на лунку) и оставляли на ночь для прикрепления. Затем клетки трансфицировали miR-221 или miR-30d. Через 48 ч после начала трансфек-ции в каждую лунку добавляли по 20 мкл раст-
вора 3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолия бромида с концентрацией 5 мг/мл (MTT, «Sigma», США) и инкубировали в течение 4 ч. Затем в лунки добавляли ДМСО и определяли поглощение при 490 нм.
Статистический анализ. Сравнение данных между двумя несвязанными группами проводили с использованием i-теста Стьюдента с помощью программы SPSS Statistical Package version 16. Уровни miPHK в разных тканях сравнивали с использованием U-теста Манна—Уитни. Значения р < 0,05 считали статистически значимыми.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сверхэкспрессия белка BMI1 в тканях раковой опухоли простаты. BMI1, член белкового семейства PcG, является маркером, используемым в биологии стволовых клеток. Есть данные, свидетельствующие о прямой положительной корреляции между уровнем BMI1 и развитием патологического процесса при некоторых типах рака. Мы определили методом вестерн-блот-тинга уровни экспрессии BMI1 в пяти образцах нормальной ткани (рис. 1, а) и 30 образцах раковой опухоли (рис. 1, б) простаты и показали, что в злокачественной ткани он был значительно более высоким по сравнению с нормой (р < 0,01).
МикроРНК регулируют экспрессию белка BMI1 в клетках PC-3. Для изучения взаимосвязи между эндогенными miPHK и экспрессией BMI1 в злокачественных клетках простаты мы блокировали экспрессию AGO2 (главный белковый компонент комплекса RISC) в клетках PC-3 и изучали в них продукцию белка BMI1. Как показано на рис. 1, в, подавление э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.