БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1997, том 23, № 6. с. 526-528
ПИСЬМА РЕДАКТОРУ
УДК 577.из.088
БЫСТРАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК В МИНИАТЮРНЫХ, СВЕРХТОНКОСТЕННЫХ МИКРОПЛАТАХ
© 1997 г. А. Н. Третьяков* Р. А. Павтина, О. К. Кабоев
Петербургский институт ядерной физики им. Б П. Константиноаа РАН, 188350, Гатчина Поступило в редакцию 22.11.96 г. Прииято к печати 03.03.97 г.
Разработан новый метод быстрой амплификации ДНК с помощью иолимеразной цепной реакции в миниатюрных, сверхтонкостенных микроплатах, формуемых непосредственно на термоблоке тер-моциклера. Микроплаты изготавливаются из тонкой (40-60 мкм) полипропиленовой пленки методом термического вакуум-формования. Благодаря эффективному переносу тепла к образцам объемом 10-15 мкл и высокой скорости нагрева и охлаждения термоблока (до 7°С/с) время, необходимое для амплификации ДНК в течение 30 циклов, составляет 15-30 мин.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция, быстрая амплификация ДНК, микроплата.
Центральным моментом при амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1,2] является циклическая инкубация реакционной смеси с последовательной сменой температур, оптимальных для синтеза фрагментов ДНК, плавления синтезированных продуктов и отжига праймеров. Применяя специальную технику амплификации ДНК в режиме "быстрых циклов" [3, 4], можно в 5-10 раз сократить время ПЦР, а также увеличить ее специфичность и чувствительность по сравнению со стандартной процедурой [5-7].
В настоящем сообщении описывается новый метод быстрой амплификации ДНК в миниатюрных, сверхтоикостенных микроплатах, формуемых на термоблоке высокоскоростного термоцикл ера [4] из термопластичных пленок (рис. 1). Тонкая (40-60 мкм) полипропиленовая пленка закрепляется с помощью прямоугольной рамки с резиновой прокладкой на термоблоке термоцик-лера, нагревается до температуры размягчения (145°С) и формуётся за счет создания разряжения порядка 0.8 атм в полости между пленкой и поверхностью термоблока. Сформованные таким образом микроплаты в 5-10 раз тоньше специальной тонкостенной пробирки для ПЦР объемом 0.5 мл. Для полипропилена характерна низкая адгезия к металлам, поэтому микроплата при формовании не прилипает к термоблоку. Специальные "ребра жесткости" по периметру микроплаты предотвращают ее изгибание во время заполнения и забора образцов. Миниатюрная мик-
# Автор для переписки (тел.: (812-71) 4-64-97; факс: (812-71) 3-23-03; e-mail: tretyakov@omrb. pnpi.spb.ru).
роплата содержит 96 лунок объемом 30 мкл каждая и имеет размеры 40 х 60 мм, что в 4 раза меньше, чем у стандартной платы с тем же числом лунок. Расстояние между лунками составляет 4.5 мм. Это позволяет использовать стандартную многоканальную пипетку при заполнении образцов. Во время проведения ПЦР микроплата плотно прижимается к поверхности термоблока с помощью создаваемого разряжения, что обеспечивает эффективный перенос тепла от термоблока к реакционной смеси объемом 10-15 мкл. Для предотвращения испарения образцов во время ПЦР микроплата с образцами, установленная на термоблоке, покрывается герметизирующей пленкой (Microseal 'A' Film, MJ Research, Inc., США), которая прижимается к термоблоку подогреваемой до 75°С крышкой. (Возможен и стандартный метод герметизации с помощью минерального масла.)
На рис. 2 представлены результаты амплификации фрагментов ДНК вирусов HIV-1 (вирус иммунодефицита человека), HPV-18 (вирус папилломы человека) и локуса Аров человека в течение 30 циклов за 20 мин. ПЦР проводили на праймер-ных системах, описанных ранее [8-10]. В качестве матриц использовали плазмиду, содержащую кДНК HIV-1 (для амплификации фрагмента ДНК HIV-1), и ДНК из клеток HeLa (для HPV-18 и АроВ). Состав реакционной смеси (15 мкл): 67 мМ трис-HCl (рН 8.8), 16.6 мМ (NH4)2S04,7 мМ MgCI2, 0.01% Tween 20, 0.25 мМ dNTP (каждый), 0.3 мкМ каждый праймер. В смесь добавляли 2.5 ед. 7я<7-ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва), 1 пг нлазмидной ДНК или 50 нг ДНК клеток HeLa.
БЫСТРАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК
527
Рис. 1. Схема формования тонкостенной микроплаты для ПЦР: I - термоблок, 2 - полипропиленовая пленка, 3 - резиновая прокладка, 4 - прямоугольная рамка, 5 - отверстие для подключения к накууму, 6 - реакционная смесь, 7 - герметизирующая пленка, & -подогреваемая крышка.
П. о. 1159 —
805 —
жиме быстрых циклов не вызывали образования неспецифичных продуктов в широком диапазоне температур отжига (данные не приведены). Это упрощает подбор условий для одновременного проведения ПЦР с разными системами праймеров.
В отличие от методов, разработанных ранее [3,4], предлагаемый метод позволяет упростить и автоматизировать процесс заполнения миниатюрной, 96-луиочной микроплаты образцами с помощью стандартной многоканальной пипетки. Разработанная техника быстрой амплификации ДНК может быть использована для решения задач, связанных с широкомасштабным применением ПЦР (секвенирование и картирование геномов, массовый ПЦР-скрининг патогенов и др.). Теоретически она позволяет проводить более 1500 реакций за 8-часовой рабочий день.
Авторы благодарят A.B. Иванова за техническую помощь в изготовлении термоцикл ер а.
516 — 44Х —
150— ■
44 — | ^шЛ
/ 2 4
Рис, 2. Электрофорез амплнфицированпых фрагментов ДНК Н1\М (2), НРУ-18 (3) и локуса АроВ (4). 1 -маркер (ДИК фага расщепленная Р.м1), указаны длины стандартов. Условия амплификации ДНК: 93°С - 30 с; последующие 30 циклов: синтез - 7Г/'С, 15 с; плавление - 93°С, 5 с; отжиг - 52°С, 3^:. Электрофорез вели в 1.7% агарозном геле в 0,08? М трис-боратном буфере, содержащем I мМ БОТА и 0.5 мкг/мл бромистого этидия.
Как видно из рис. 2, даже при указанных коротких временах синтеза, плавления и отжига обеспечивается высокий выход продуктов ПЦР (для электрофореза использовали только 1/30 объема реакционной смеси), т.е. при высокотемпературном формовании микроплаты не образуются продукты, ингибирующие ПЦР. Три различные праймерные системы, которые в условиях медленной смены температуры реакционной смеси обеспечивали амплификацию ДНК при разных температурах отжига и концентрациях ионов магния [8-10], при проведении ПЦР в ре-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mullis КВ., Faloona FA. // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-350.
2. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S.. Scarf S.J., Higu-chiR., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. // Science. 1988. V. 239. P. 4S7—491.
3. Wittwer C.T., Fillmore G.C., Garling DJ. // Anal. Bio-chem. 1990. V. 186. P. 328-331.
4. Tretyakov A.N., Gelfand V.M., Pantina R.A., Shevt-sm> S.P., Bulat SA. II Mol. Biol. (Engl.Tr.). 1994. V. 28. p. 441-443.
5. Wittwer C.T., Gar ling D.J. // В i (Techniques. 1991. V. 10. P. 76-83.
6. Tan S.S., Weis J.H. II PCR Methods Appl. 1992. V. 2. P. 137-143.
7. Honda J., Hoshino Т., Natori H„ Tokisawa S„ Aki-yoshiH., Nakahara S., Oizumi K. // Br. J. Haematol. 1994. V. 86. P. 138-142.
8. Ou C.Y., К wok S., Mitchell S.W., Mack D.H., Snin-sky J .J., Krebs J.W., Feorino P., Warfield £>., Schochet-man G. II Science. 1988. V. 239. P. 295-297.
9. Schiffman M.H., Bauer H.M., LorinczA.T., Manos M.M., Byrne J.C., Glass AG., Cadell D.M., Howley P.M. I I J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 573-577.
10. Boerwinkle E., Lee S.S., Butler R., Schumaker V.N., Chan L. // Atherosclerosis. 1990. V. 81, P. 225-232.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 23 № 6 1997
528
ТРЕТЬЯКОВ и др.
Fast DNA Amplification in Tiny Ultrathin Microplates
A. N. Tretyakov, R. A. Pantina, and O. K. Kaboev
Konstantinov Petersburg Institute fur Nuclear Physics, Russian Academy of Sciences, /88350 Gatchina Received November 22, 1996; in final form. Marsh 03, 1997
Abstract—A new method was developed for fast DNA amplification by polymerase chain reaction in tiny ultrathin microplates formed directly on the thermocycler's thermoblock. The microplates are made from thin (40-60 ^m) polypropylene film by the thermal vacuum-formation method. Due to the effective heat transfer to 10—15 |il samples and a high velocity of heating and cooling of the thermoblock (up to 7°C/s), the total duration of the DNA amplification (30 cycles) is only 15-30 min.
Key words: polymerase chain reaction, fast DNA amplification, microplate.
Формат бумаги 60 x 88'/s Уч.-изд. л. 10. 8 Бум. л. 6.0
Сдано в набор 05.03.97 г. Офсетная печать Усл. печ^л.
Подписано к печати 13.05.97 г. 12.5 Усл. кр.-отт. 3.9 тыс.
Тираж 357 экз. Зак. 1719
Отпечатано в Московской типографии № 2 РАН, 121099, Москва, Г-99, Шубинский пер., 6
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.