УДК 576.385.5
БЫСТРОЕ ПОДАВЛЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ
© 2010 г. М. О. Емельянов, Ю. А. Ким*, А. Ф. Корыстова, Л. Н. Кублик, В. В. Шапошникова, Ю. Н. Корыстов
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;
электронная почта: ykorystov@rambler.ru;
*Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области Поступила в редакцию 19.01.2010 г.
Изучено действие кратковременного (1 ч) окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) клеток мышиного лейкоза Р388ВР. Оценивали влияние состава среды, концентрации клеток и перекиси водорода на образование активных форм кислорода (АФК), а также действие окислительного стресса на МЛУ клеток. МЛУ определяли по откачке из клеток эфира кальцеина — субстрата транспортных белков, и по их чувствительности к винкристину. Содержание АФК в клетках определяли с помощью 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (ДХФН2). Показано, что образование АФК в клетках снижается при добавлении в среду сыворотки, увеличении концентрации клеток и возрастает прямо пропорционально увеличению концентрации перекиси водорода. Окислительный стресс, создаваемый добавлением в среду 30—300 мкМ перекиси водорода, снижает МЛУ клеток. Эффект перекиси водорода возрастает при увеличении концентрации и времени воздействия. По критерию откачки из клеток эфира кальцеина МЛУ полностью подавляется через 1 ч при концентрации перекиси водорода, равной 300 мкМ. Обработка клеток Р388ВР перекисью водорода (60 мкМ, 1 ч) приводит к повышению их чувствительности к винкристину, которая становится такой же, как у клеток дикого типа Р388. Быстрое, в пределах часа, подавление МЛУ обусловлено ингибированием активности транспортных белков. Снижение МЛУ опухолевых клеток, подвергнутых окислительному стрессу, может использоваться в терапии опухолей, устойчивых к противоопухолевым препаратам.
Ключевые слова: активные формы кислорода, винкристин, лейкозные клетки, множественная лекарственная устойчивость, перекись водорода.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток часто обусловлена увеличенной экспрессией транспортных белков, включая Р-гликопротеин (Р-яр), функционирующих как энергозависимый транспортный насос, который снижает концентрацию противоопухолевых средств в клетках [1, 2]. Экспрессия Р-§р в опухолях может быть одним из главных препятствий к эффективному проведению химиотерапии, особенно в опухолях гемопоэтического происхождения [3, 4]. Р-§р млекопитающих кодируется семейством генов, известных как МБЯ-гены. У человека идентифицированы два гена этого семейства: МБЯ1, связанный с МЛУ, и МБЯ2, участвующий в транспорте липидов [2, 5]. У мы-
Сокращения: АФК — активные формы кислорода, ДХФ — 2',7'-дихлорфлуоресцеин, ДХФН2 — 2',7'-дихлордигидро-флуоресцеин, МЛУ — множественная лекарственная устойчивость, Р-яр — Р-гликопротеин.
шей и крыс известны три гена этого семейства: mdrla, mdrlb и mdr2 [6, 7]. С МЛУ связаны только mdrla и mdrlb, а mdr2 кодирует белок, транспортирующий липиды. МЛУ опухолевых клеток определяется как количеством, так и активностью транспортных белков.
Количество транспортных белков в клетках зависит от экспрессии генов, а их активность может регулироваться посттрансляционной модификацией (присоединение фосфатных групп, окисление SH-групп), состоянием мембраны, концентрацией АТР и другими факторами. При окислительном стрессе увеличивается экспрессия гена mdrlb в гепатоцитах и клетках гепатомы крыс [8, 9] и генов mdrla и mdrlb в клетках эндотелия сосудов мозга крыс [10]. В клетках опухолей предстательной железы человека окислительный стресс подавляет экспрессию гена MDRl, а гипоксия увеличивает ее [11, 12]. Показано также, что
устойчивость клеток глиомы человека к противоопухолевым препаратам при гипоксии увеличивается, а экспрессия генов транспортных белков при этом не измененяется [13]. Приведенные данные указывают на то, что изменение оксиге-нации клеток (окислительный стресс) может влиять как на экспрессию транспортных белков, так и на их функциональную активность. Ранее нами было показано [14, 15], что транспорт субстрата Р-§р — эфира кальцеина, из клеток устойчивого к винкристину штамма мышиного лимфолейкоза Р388 (Р388ВР) и устойчивость этих клеток к вин-кристину усиливаются по мере роста опухоли и уменьшения содержания активных форм кислорода (АФК). МЛУ клеток Р388ВР возникает в результате длительной обработки клеток дикого типа винкристином и сверхэкспрессии гена ш&1а, обусловленной вставкой генома ретровируса лейкоза мышей (М^У) в 5'-фланкирующую область [16]. Таким образом, в клетках эндотелия крысы [10] окислительный стресс увеличивает экспрессию гена ш^1а, а в клетках Р388ВР [14, 15], МЛУ которого связана с этим же геном, окислительный стресс снижает МЛУ и транспорт субстрата Р-§р. Это противоречие можно объяснить тем, что АФК ингибируют активность Р-§р. Мы не обнаружили публикаций, в которых изучали влияние АФК на функцию Р-§р. Показано [14], что МЛУ клеток Р388ВР снижается после каждого перевивания опухоли. При перевивании малое количество клеток помещают в брюшную полость, где оксигенация клеток и АФК в них резко возрастают по сравнению с гипоксическими условиями в большой опухоли. Если АФК подавляют активность белка Р-§р, то увеличение количества АФК должно приводить к быстрому уменьшению МЛУ. Если же при повышении содержания АФК экспрессия гена Р-§р в клетках снижается, то МЛУ не может быстро уменьшиться, поскольку количество Р-§р в клетках начинает уменьшаться только через 12 ч после подавления экспрессии гена [17]. Низкая скорость снижения уровня Р-§р при прекращении его синтеза обусловлена медленной его деградацией: количество Р-§р в различных клетках снижается в 2 раза за 18.3-19.1 ч [17].
В настоящей работе изучено влияние кратковременной обработки клеток перекисью водорода (1 ч) на транспорт ацетоксиметилового эфира кальцеина и устойчивость клеток Р388ВР к вин-кристину.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали раствор Хенкса с добавлением 20 мМ НЕРЕ8, среду RPMI-1640, модифицированную 20 мМ НЕРЕ8, и Х-глутамина
без бикарбоната, эмбриональную телячью сыворотку, гентамицин, трипановый синий, дигито-нин, ингибитор транспортных белков циклоспорин А, ацетоксиметиловый эфир кальцеина и 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (ДХФН2-ДА) фирмы "Sigma" и аптечный препарат перекиси водорода (3%). Противоопухолевый препарат винкристин был получен из "Gedeon Richter" (Венгрия). Матричный раствор ацеток-симетилового эфира кальцеина (2 мМ) готовили на диметилсульфоксиде, а исходные растворы ДХФН2-ДА (10 мМ) и циклоспорина А — в этаноле. Винкристин (3.3 мМ) растворяли в физиологическом растворе с добавкой 0.9% бензилового спирта. Все матричные растворы хранили при - 20°С.
Клетки лимфолейкоза Р388 выращивали в брюшной полости 8—10 недельных самцов мышей ДВА2 (коллекция животных Института биоорганической химии, Пущино). Мышей содержали группами по 20 особей в клетках размером 35 х 25 х 15 см при температуре 22 ± 2°С, 12 ч световом цикле и свободном доступе к пище и воде. Эксперименты были одобрены этическим комитетом Института. Устойчивые к винкристину клетки Р388 получали с помощью обработки мышей с опухолями винкристином (1 мкг/кг). Вин-кристин вводили в брюшную полость через день после прививки опухолевых клеток (2 х 106 клеток на мышь). После увеличения количества клеток в брюшной полости (через 7 сут после прививки) клетки перевивали, а еще через сутки вводили винкристин (1 мг/кг). Эту процедуру повторяли 6 раз. Полученная линия клеток, названная Р388ВР, обладала устойчивостью к винкристину. Для опытов in vitro клетки обоих типов (Р388 и Р388ВР) извлекали из брюшной полости мышей через 6—7 дней после прививки по 0.5 х 106 клеток на мышь. Клетки помещали в 3 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки, центрифугировали в течение 5 мин при 700 g, затем осадок переносили в такую же среду и повторно центрифугировали. Для определения активности транспортных белков клетки после последнего центрифугирования помещали в раствор Хенкса с 1% сыворотки или в среду RPMI-1640 с 10% сыворотки — для определения чувствительности клеток к винкристину или перекиси водорода. Все процедуры выполняли при комнатной температуре.
Для определения выживаемости клетки (3 мл клеточной суспензии различной концентрации на чашку) помещали в пластиковые чашки диаметром 3 см со средой RPMI-1640 с 10% сыворотки и гентамицином (40 мкг/мл). Клетки выдерживали в течение 30 мин для адаптации к темпе-
е
Е
35 30 "25 20 15
§10 <
5
0
** т
Рис. 1. Количество АФК в клетках Р388ВР. 1 — Контрольные клетки в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки и 3 — в среде RPMI-1640 и в растворе Хенкса. 2, 4, 5 — Клетки, подвергнутые воздействию 10 мкМ перекиси водорода в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки (2), в среде RPMI-1640 (4) и в растворе Хенкса (5). Концентрация клеток 1.2 млн/мл (п = 4). * Р < 0.05 по отношению к (1); ** Р < 0.05 по отношению к (2). ОЕФ — относительные единицы флуоресценции.
ратуре 37°С и инкубировали с винкристином или перекисью водорода в течение 1 ч при 37°С. Затем клетки дважды отмывали от винкристина или перекиси водорода раствором Хенкса с 1% сыворотки и инкубировали в пластиковых чашках диаметром 3 см (3 мл суспензии, содержащей 1.2 —1.5 х 106 клеток/мл, на чашку) в течение 22 ч в атмосфере 5% СО2 и среде RPMI-1640 с 10% сыворотки и гентамицином. По окончании инкубации клетки окрашивали 0.04% раствором трипа-нового синего и определяли долю мертвых клеток. Влияние на выживаемость клеток оценивали по соотношению живых клеток в опытных вариантах (Да) и в контроле (Дс) через 22 ч инкубации: Б,% = Да/Дс х 100%.
Активность транспортных белков в клетках определяли по скорости образования кальцеина из ацетоксиметилового эфира кальцеина, а МЛУ — по изменению скорости образования кальцеина в присутствии циклоспорина А — ингибитора МЛУ. Этот метод был разработан нами ранее [14] на основе метода, описанного в [18]. Субстрат транспортных белков ацетоксиметило-вый эфир
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.