БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 380-386
УДК 577.354.22
Cа2+-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОВЕРИНА В ФОТОРЕЦЕПТОРНЫХ РАФТ-СТРУКТУРАХ: РОЛЬ КАВЕОЛИНА-1
© 2013 г. Е. Ю. Зерний1, Д. В. Зинченко2, В. И. Владимиров2, И. И. Григорьев1, Е. Е. Скорикова1, В. Е. Бакшеева1, В. М. Липкин2, П. П. Филиппов1, И. И. Сенин1*
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40;
*электронная почта: senin@belozersky.msu.ru 2Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,
Московская обл., Пущино, просп. Науки, 6 Поступила в редакцию 28.04.2013 г.
Фоторцепторный Са2+-связывающий белок рековерин принимает участие в Са2+-зависимой регуляции десенситизации зрительного рецептора родопсина в палочках сетчатки позвоночных животных. Обнаружено, что в присутствии фоторецепторных мембран, обогащенных рафт-структурами, происходит повышение Са2+-чувствительности модулируемого рековерином процесса десенситизации родопсина. Установлено, что наблюдаемый эффект опосредован ключевым белковым компонентом рафт-структур кавеолином-1. Так, присутствие рекомбинантного фрагмента РЬе81—Лг§101 цитоплазматического домена кавеолина-1 повышает сродство рековерина к ионам кальция и, как следствие, отражается на его Са2+-зависимой регуляторной активности.
Ключевые слова: фоторецепция, родопсин, родопсинкиназа, рафт-струткуры, кавеолин, рековерин.
Б01: 10.7868/80233475513050253
Рафт-структуры представляют собой устойчивые к воздействию неионных детергентов мембранные компартменты, которые обогащены холестерином и содержат целый ряд различных белков, относящихся, в основном, к сигнальным системам клетки [1]. Одним из ключевых белковых компонентов рафт-структур является кавео-лин-1 — интегральный мембранный белок с молекулярной массой 22 кДа, способный связывать холестерин и принимать участие в его транспорте [2]. Считается, что кавеолин-1, как структурный компонент мембранных рафтов, взаимодействует с сигнальными белками посредством специального "поддерживающего" цитоплазматического домена (аминокислотые остатки РИе81—Лг§101) и, таким образом, организует их сигнальную активность [3]. Принимая во внимание функциональную важность рафт-структур, в последнее время усилия многих лабораторий сосредоточены на поиске этих компартментов в мембранах клеток различных типов. Так, рафт-структуры обнаружены в наружных сегментах фоторецепторных клеток позвоночных животных (НСП — наружный сегмент фоторецепторной клетки палочки) [4—6], где они локализованы в так называемых фоторе-цепторных дисках — плотно упакованных замкнутых фрагментов мембраны, содержащих в своем составе зрительный пигмент родопсин, и за
счет этого выполняющих важнейшую роль в фоторецепции. Установлено, что фоторецепторные рафт-структуры содержат целый ряд белков, принимающих участие в передаче зрительного сигнала — фототрансдукции. Некоторые из этих белков, например, О-белок трансдуцин и его эффектор-ный белок сОМР-фосфодиэстераза, способны транслоцироваться в рафт-структуры светозависи-мым образом [4, 5]. Другие же — кавеолин-1 и гу-анилатциклаза-Е (Я08-ОС1) — присутствуют в рафт-структурах вне зависимости от освещения [4]. Недавно в фоторецепторных рафт-структурах нами обнаружен белок рековерин [6] (молекулярная масса 23.3 кДа) — нейрональный кальциевый сенсор, Са2+-зависимым образом модулирующий активность родопсинкиназы и за счет этого вовлеченный в регуляцию десенситизации родопсина [7—12]. Рековерин содержит четыре потенциальных Са2+-связывающих центра типа ЕБ-Иапё, из которых только два центра, второй и третий ("ЕБ2" и "ЕБ3"), способны связывать кальций [13—17]. вконец рековерина ацилирован остатком мири-стиновой кислоты, причем в отсутствие Са2+ ми-ристоильная группа погружена в гидрофобный карман внутри молекулы белка [18]. Связывание кальция с двумя функциональными участками в миристоилированном рековерине происходит кооперативно в следующем порядке: вначале за-
полняется высокоаффинный EF3, что облегчает связывание Са2+ в низкоафинный EF2 [13—15]. При этом происходит ряд конформационных изменений в молекуле рековерина, в результате которых миристоильная группа и аминокислотные остатки гидрофобного кармана экспонируются в раствор (этот механизм получил название Са2+/миристоильного переключателя) [19, 20]. За счет миристоильной группы рековерин способен взаимодействовать с мембранами фоторецептор-ных дисков [21]. Аминокислотные остатки, входящие в состав гидрофобного кармана, а также остатки С-концевого сегмента рековерина принимают участие во взаимодействии этого белка с его внутриклеточной мишенью — родоп-синкиназой [22, 23]. Показано, что рековерин способен иммунопреципитировать из клеточных ли-затов совместно с кавеолином-1 [24]. Эти данные, а также обнаруженная нами локализация рекове-рина в фоторецепторных рафт-структурах [6], позволяют рассматривать возможность образования сигнального комплекса между рековерином и кавеолином-1 в условиях in vivo. В настоящей работе мы изучали влияние рафт-структур на Са2+-зависимую функциональную активность ре-коверина, а также роль основного интегрального компонента мембранных рафтов, кавеолина-1, в регуляции этой активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Наружные сегменты палочек (НСП), отмытые мочевиной мембраны НСП (фоторецепторные мембраны) и фоторецепторные мембраны, обогащенные рафт-структурами, получали из сетчаток крупного рогатого скота, используя методики, описанные ранее [6, 26, 27].
Родопсинкиназу получали из НСП как описано ранее [28].
Миристоилированный рекомбинантный ре-коверин получали, используя процедуру, разработанную нами ранее [14].
Генетическую конструкцию, кодирующую фрагмент цитоплазматического домена кавеоли-на-1 в виде химерного белка с глутатион-8-транс-феразой (GST), получали в соответствии со стандартными методиками клонирования [10, 29]. В качестве матрицы использовали синтетический ген кавеолина-1 Bos taurus. Фрагмент гена, соответствующий участку Phe81—Arg101 кавеолина-1, амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали в экспрессионный вектор pGEX5x-1 (GE Healthcare, Великобритания) по сайтам рестрикции эн-донуклеазами BamHI и Sali. Полученную генетическую конструкцию (GST-cav) экспрессировали в Escherichia coli штамм BL21-CodonPlus (DE3)-RP, индуцируя клетки добавлением 0.5 мМ изо-пропил^^-тиогалактозида. Очистку рекомби-нантного GST-cav из клеточных лизатов прово-
дили с помощью аффинной хроматографии на глутатионсефарозе (GSTrap, GE Healthcare). Связывание белков с аффинным носителем проводили в 50 мМ трис-HCl буфере рН 8.0, содержащем 1 мМ DTT. GST-cav элюировали тем же буфером, в котором дополнительно присутствовал восстановленный глутатион (10 мМ). Избыток глутати-она в из белковых препаратов удаляли с помощью диализа.
Фосфорилирование родопсина проводили в реконструированной системе, содержащей очищенные родопсинкиназу и рековерин [23, 30], в присутствии отмытых мочевиной фоторецепторных мембран или фоторецепторных мембран, обогащенных рафт-структурами. Реакцию проводили в смеси (конечный объем 50 мкл) следующего состава: 20 мМ трис-HCl буфер, рН 7.5, содержащий 2 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, 3 мМ Br2BAPTA или 2 мМ EGTA, 0-100 мкМ [Ca2+]f, 1 мМ [у32-Р]АТР (удельная активность 30100 имп/мин/пмоль), 10 мкМ родопсин, родоп-синкиназа (0.3 единицы активности) и 30 мкМ рековерин. Реакционную смесь готовили в темноте; ферментативную реакцию начинали, освещая пробу лампой накаливания. Через 30 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 20-кратного избытка 10% трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали (10 мин, 5000 g), су-пернатант отбрасывали, а осадок фоторецепторных мембран ресуспендировали в 10% трихлоруксусной кислоте. Процедуру отмывки осадка мембран 10% трихлоруксусной кислотой повторяли 4 раза, после чего определяли включение 32Р в родопсин методом жидкостно-сцинтилляционного счета.
Связывание Са2+ с рековерином определяли методом ультрафильтрации. Метод включал следующие стадии [14]. В верхний отсек концентратора Centricon-10 (задерживает белки размером свыше 10 кДа) помещали 0.5 мл 10 мкМ раствора рековерина в 20 мМ HEPES-буфере, рН 7.5, содержащем 100 мМ NaCl и 1 мМ DTT, в который были добавлены 10 мкл 0.2 мМ раствора 45CaCl2 (0.4-0.5 мкКи). Пробы центрифугировали (1 мин, 7000 g), из нижнего и верхнего отсеков концентратора отбирали по 15 мкл раствора и измеряли радиоактивность этих растворов методом жидкост-носцинтилляционного счета. Далее в верхний отсек концентратора, в котором присутствовал задержанный фильтром белок, добавляли 15 мкл 0.2 мМ раствора нерадиоактивного Са02, после чего пробы вновь центрифугировали. Процедуру добавления раствора нерадиоактивного CaCl2 и центрифугирования повторяли несколько раз таким образом, чтобы расчетная концентрация свободных ионов кальция достигала примерно 300 мкМ (при более высоких значениях этой величины ошибка опыта значительно возрастает). Результаты описанного опыта обрабатывали по формуле:
Cafree — Rf/Rp Cai
2+
•total,
382
ЗЕРНИЙ и др.
[Са2+]СВОб, мкМ
Рис. 1. Влияние рафт-структур на способность рековерина ингибировать родопсинкиназу Са2+-зависимым образом. Относительную активность родопсинкиназы в реакции фосфорилирования родопсина определяли при различных концентрациях свободного Са2+ в реконструированной системе, содержащей рековерин (30 мкМ), а также интактные фоторецепторные мембраны (•) или фоторецепторные мембраны, обогащенные рафт-структурами (О) (см. "Материалы и методы").
где Я—уровень радиоактивности в растворе нижнего отсека, Яр — уровень радиоактивности в растворе верхнего отсека, Са2+ее и СаОы — свободная и общая концентрация Са2+ соответственно. Количество связанного Са2+ (V, моль/моль белка) рассчитывали по формуле:
N = (Са2+а1 — Са2гее ) /роЫ,
где Р1о1а1 — общая концентрация белка в пробе.
Концентрацию родопсина в препаратах фото-рецепторных мембран определяли как описано в работах [31, 32]. Концентрацию дру
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.