МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2OOS, том 42, № 4, с. 571-5SO
== ÉEHOMËKA. TPAHCKPËÔTOMËKA. ÈPOTEOMËKA ^
УДК 577.21
CCSP-МАРКЕРЫ ПШЕНИЦЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ОСНОВНЫМ ЛОКУСОМ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ПРИЗНАКА, КОТОРЫЙ ОПРЕДЕЛЯЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФУЗАРИОЗУ КОЛОСА
© 200S г. G. H. Yu12, H. X. Ma2*, G. H. Bai3, K. X. Tang1*
1Plant Biotechnology Research Center, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 2OOO3O, China 2Institute of Agricultural Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 21OO14, China 3USDA-ARS, Plant Science and Entomology Research Unit, 4OOS Hrockmorton Hall, Manhattan, KS 665O6, USA
Поступила в редакцию 26.06.2007 г. Принята к печати 03.12.2007 г.
Основной локус количественного признака (QTL), который связан с устойчивостью к фузариозу колоса (Fusarium Head Blight) у пшеницы сорта Ning 7S40, расположен на хромосоме 3BS между SSR-маркерами Xgwm3S9 и Xgwm493. Однако плотность SSR-маркеров в районе QTL оказалось намного ниже, чем это необходимо для отбора по маркерам (MAS) и клонирования на основе карты. Цель данной работы - привлечь новые маркеры с тем, чтобы повысить их плотность в данном районе QTL. Для этого оценивали маркеры, выявляемые при использовании метода SSCP (одноцепочечный конформационный полиморфизм) на основе участка EST S-0.7S-1.0 хромосомы 3BS пшеницы. Продукты ПЦР на матрице ДНК сорта Chinese Spring получены при использовании 69-й из 85-й исследованных пар праймеров в SSCP-анализе. Продукты ПЦР, синтезированные с использованием 34 пар праймеров, при денатурации давали четкие полосы одноцепочечной ДНК (оцДНК). По десяти SSCP-маркерам выявлялся полиморфизм между сортами Ning 7S40 и Clark. Пять из десяти полиморфных SSCP-маркеров локализованы на хромосоме 3B при нулли-тетрасомном анализе. Три SSCP-маркера (Xsscp6, Xsscp20 и Xsscp21) картированы в участке между маркерами Xgwm493 и Xgwm533, а их коэффициент детерминации (R2) был выше, чем у Xgwm493 и Xgwm533. SSCP-маркеры Xsscp6, Xsscp20 и Xsscp21 могут быть использованы для клонирования QTL на основе карты и для отбора по маркерам при селекции на устойчивость к фузариозу.
Ключевые слова: Triticum aestivum, фузариоз колоса, маркирование QTL, SSCP.
SINGLE-STRAND CONFORMATIONAL POLYMORPHISM MARKERS ASSOCIATED WITH A MAJOR QTL FOR FUSARIUM HEAD BLIGHT RESISTANCE IN WHEAT, by G. H. Yu12, H. X. Ma2*, G. H. Bat3, K. X. Tang1* ^Plant Biotechnology Research Center, Fudan-SJTU-Nottingham Plant Biotechnology R&D Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University; Shanghai 200030, China, *e-mail: kxtang@sjtu.edu.cn; 2Institute of Agricultural Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China, *e-mail: mahx@jaas.ac.cn; 3USDA-ARS, Plant Science and Entomology Research Unit, 4008 Hrockmorton Hall, Manhattan, KS 66506, USA). A major quantitative trait locus (QTL) associated with resistance to Fusarium head blight (FHB) was identified on chromosome 3BS between simple sequence repeat (SSR) markers Xgwm389 and Xgwm493 in wheat 'Ning 7840', a derivative from 'Sumai 3'. However, the marker density of SSR in the QTL region was much lower than that required for marker-assisted selection (MAS) and map-based cloning. The objective of this study was to exploit new markers to increase marker density in this QTL region by using single-strand conformational polymorphism (SSCP) markers developed from
Принятые сокращения: QTL (Quantitative Trait Locus) - основной локус количественного признака; FHB (Fusarium Head Blight) - фузариоз колоса; 3BS (the short arm of chromosome 3B) - короткое плечо хромосомы 3B; RIL (Recombinant Inbred Line) - рекомбинантная инбредная линия; MAS (Marker-Aassisted Selection) - отбор по маркерам; EST (Expressed Sequence Tag) - экспрессируемая маркерная мишень; ПЦР - полимеразная цепная реакция; оцДНК - одноцепочечная ДНК; R2 (Coefficient of Determination) - коэффициент определения; cM (Centimorgan) - сантиморганида; RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов; AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) -полиморфизм длин амплифицированных фрагментов; STS (Sequence Tagged Site) - последовательность участка мишени; SSCP (Single-Strand Conformational Polymorphism) - одноцепочечный конформационный полиморфизм; SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм; indel (insertion or deletion) - инсерция-делеция; TA (Annealing Temperature) - температура отжига; TBE buffer (Tris-Borate Electrophoresis Buffer) - Трис-боратный буфер для электрофореза; BAC (Bacterial Artificial Chromosome) - искусственная хромосома бактерий; LRS (Likelihood Ratio Statistics) - индекс отношения правдоподобия; PAC (Phage P1-derived Artificial Chromosome) - искусственная хромосома на основе фаговых ДНК.
* E-mail: mahx@jaas.ac.cn, kxtang@sjtu.edu.cn
wheat expressed sequence tags (ESTs) on 3BS bin 8-0.78-1.0. Sixty-nine out of 85 SSCP primer pairs amplified PCR (polymerase chain reaction) products from the genomic DNA of 'Chinese Spring'. Thirty-four primer pairs amplified PCR products that could form clear ssDNA (single strand DNA) bands through denaturation treatment. Ten SSCP markers had polymorphisms between 'Ning 7840' and 'Clark'. Five of the ten polymorphic SSCP markers were located on chromosome 3B by nulli-tetrasomic analysis. Three SSCP markers (Xsscp6, Xsscp20, and Xsscp21) were mapped into the region between Xgwm493 and Xgwm533, and possessed higher coefficient of determination (R2) than Xgwm493 and Xgwm533. The SSCP markers, Xsscp6, Xsscp20, and Xsscp21, can be used for map-based cloning of the QTL and for marker-assisted selection in FHB resistance breeding.
Key words: Triticum aestivum, Fusarium Head Blight, QTL tagging, SSCP.
Фузариоз колоса, вызываемый в основном грибком Fusarium graminearum, представляет собой заболевание пшеницы, встречающееся во всем мире [1]. С 1993 по 1997 г. несколько сильных вспышек фузариоза привели к серьезному экономическому ущербу в Северной Америке; только в 1993 г. потери в США составили более 1 миллиарда долларов [2]. В Китае под угрозой фузариоза находится четверть всех посевных площадей пшеницы (около 6.7 млн гектаров) [3]. Фузариоз не только приводит к значительным потерям урожая, но и снижает качество зерна [4]. Кроме того, при загрязнении зерна микотоксинами возникает существенный риск здоровью человека и домашнего скота [4]. Потери от этого заболевания можно снизить путем применения фунгицидов, но это неизбежно повышает стоимость производства зерна и приводит к загрязнению окружающей среды. Наиболее экономичный и эффективный способ борьбы с фузариозом - вывести новые сорта пшеницы, обладающие высокой устойчивостью к данному заболеванию. Однако фенотипическую оценку устойчивости к фузариозу проводить достаточно сложно, из-за существенного влияния окружающей среды на генотип, а скрининг на устойчивость к фузариозу весьма трудоемок, дорог и требует много времени [5]. Альтернативным методом, позволяющим проводить селекцию на устойчивость к фузариозу, а также повысить ее эффективность, может стать отбор по маркерам (marker-assisted selection, MAS).
В качестве источника растений, устойчивых к фузариозу, в селекционных программах разных стран широко используются китайский сорт Sumai 3 и его производные. У полученного на основе этого сорта сорта Ning 7840 с помощью AFLP-маркеров (см. Сокращения) найден один из основных локусов количественного признака (QTL, см. Сокращения), отвечающих за устойчивость к фузариозу; наличие этого локуса заметно снижает тяжесть заболевания фузариозом [6]. Показано, что данный QTL локализован в коротком плече хромосомы 3В. На его флангах находятся два SSR-маркера (см. Сокращения), Xgwm389 и Xgwm493 [7]. Один из AFLP-маркеров, ассоциированных с этим QTL, использован для получения STS-маркера [8]. Однако этот маркер
оказался доминантным, и при полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмент амплифицируется только у восприимчивых сортов. Как следствие, если использовать отбор по данному маркеру в программе селекции пшеницы, трудно различить, устойчив ли генотип или имеются ошибки при ПЦР-амплифика-ции. На основе EST разработаны и другие STS-мар-керы данного QTL [9], но лишь в случае маркера 2BSSTS-256 показано тесное сцепление с QTL. К сожалению, для маркера 2BSSTS-256 характерны те же недостатки, что и для маркера, полученного Гуо и соавт. [8].
Таким образом, разработка маркеров, более тесно сцепленных с данным локусом, представляет собой актуальную задачу.
Анализ конформационного полиморфизма оцДНК (SSCP, см. Сокращения), предложенный Орита и соавт. [10], позволяет достаточно просто и экономично получить систему кодоминантных маркеров для выявления полиморфных сайтов в последовательности ДНК [10]. Полиморфизм определяется тем, что различия в нуклеотидах, приводящие к стабильным изменениям конформации оцДНК, приводят к изменениям подвижности соответствующих фрагментов при электрофорезе. Анализ SSCP-маркеров проводится на основе ПЦР и не требует другого оборудования по сравнению с анализом SSR-маркеров, причем в первом случае можно выявить гораздо больше полиморфных сайтов. К изменению конформации оцДНК приводят как различия в одиночных нуклеотидах, так и инсерции/делеции (индели). Таким образом, SSCP-анализ может оказаться полезным для выявления полиморфизма геномов по единичным характеристикам (SFP, см. Сокращения) с целью разработки высокопродуктивной системы маркеров для отбора растений при селекции.
Хотя геном пшеницы полностью не секвениро-ван, его картирование возможно с помощью имеющихся последовательностей EST. EST определенного участка хромосомы представляют собой хорошую основу для поиска маркеров, сцепленных с QTL из этого же участка. Более 150 EST пшеницы картированы в районе 3BS 8-0.78-1.0 (http://wheat.pw.us-da.gov/NSF), в котором расположен основной локус QTL устойчивости к фузариозу - Qfhb_3BS [7, 11].
CCSP-МАРКЕРЫ ПШЕНИЦЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ОСНОВНЫМ ЛОКУСОМ
573
Не
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.