БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.5, c.797-801
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.344:579.246.6
СЕНСИБИЛИЗИР УЕМЫЕ ПР ОТОПОР ФИР ИНОМ IX ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯ СПОР ГРИБОВ РОДА Fusarium
© 2008 г. А.В. Воробей, С.В. Пинчук
Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, 220072, Минск, ул. Академическая, 27, Беларусь Поступила в p едакцию 09.01.08 г. После доработки 26.05.08 г.
И сследовано фотодинамическое воздействие с использованием в качестве сенсибилизатор а протопорфир ина IX на со стояние компонентов гидратированных спор микопатогенов р ода Fusarium и прорастание конидий в питательной среде. Показано, что протопорфирин IX в микромолярных концентрациях сенсибилизирует фотоокисление белков и липидов гидрати-рованных спор грибов ^Fusarium poae и Fusarium си1тогит при освещении их суспензий в дозах 50 - 200 кДж/м . Установлено, что фотосенсибилизированное окисление клеточных компонентов приводит к нарушению пр оницаемости мембран и подавлению пр о р астания спор при последующем их культивировании в питательной среде.
Ключевые слова: фотодинамическое воздействие, протопорфирин IX, грибы рода Fusarium, окисление белков и липидов, прорастание конидий.
Снижение вызываемых микопатогенами заболеваний зерновых культур - важный резерв увеличения продуктивности сельскохозяйственных растений и повышения качества урожая. Одним из основных способов распространения микофлоры является инфицирование семян растений. В настоящее время в борьбе с грибковыми болезнями широко используются химические пр отравители - фунгициды, применение которых не всегда освобождает семена от инфекции и может приводить к появлению резистентных форм патогенов [1]. В связи с этим остро стоит задача разработки альтернативных способов очистки семян от патогенной микофлоры. Одним из перспективных подходов, позволяющих получить фунгицидный эффект, является фото динамическое воздействие (ФДВ) [2]. Суть этого метода состоит в освещении биологических систем в присутствии красителей-фотосенсибилизаторов и кислорода, пр иво-дящем к образованию высокоактивного синг-летного кислорода и свободных радикалов, способных окислять биомолекулы. В настоящее время фотодинамическое воздействие успешно используется в медицине: в фотодинамической терапии онкологических заболеваний [3,4], для подавления вирусной [5,6], бактериальной [7,8] и грибной [9,10] инфекций. Вместе с тем в сельскохозяйственной практике, в частности, для борьбы с грибковыми инфекциями указан-
Сокращения: ФДВ - фотодинамическое воздействие, ПП - протопорфирин IX, ТБК - тиобарбитуровая кислота.
ный метод пока не нашел широкого применения. Одной из причин этого является недостаточная изученность механизмов фотодинамического повреждения спор и фунгицидной активности ФДВ в отношении микопатогенов, поражающих сельскохозяйственные культур ы. Цель настоящей работы состояла в изучении фотодинамического воздействия с использованием в качестве фотосенсибилизатора прото-порфирина IX (ПП) на состояние компонентов спор микопатогенов рода Fusarium и их прорастание в питательной среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
И спользовали протопор фирин IX и меро-цианин 540 фир мы Sigma, остальные реактивы -отечественного производства марки хч или чда.
Объектами исследования служили споры грибов Fusarium poae и Fusarium oulmorum, выделенные из пораженных зерновок ярового ячменя. Споры гидратир овали в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (р Н 7,4) в течение 2 ч при 20°С, концентрация спор Fusarium poae - 1-106, Fusarium oulmorum - 5-105 спор/мл. В суспензию гидратированных конидий вводили протопор-фирин IX в концентрации (1 - 4) -10-6 М (к 2 мл суспензии добавляли 5-20 мкл раствора протопорфирина IX (4-10-4 М) в диметилсуль-фоксиде). Образцы инкубировали с сенсибилизатор ом в течение 30 мин и освещали в чашках Петри светом слайд - проектор а (галогеновая лампа 150 Вт) при плотности мощности свето-
798
ВОРОБЕЙ, ПИНЧУК
t, мин
Рис. 1. Кинетики увеличения интенсивности флуоресценции протопорфирина IX при введении пор-фирина в суспензии конидий F. poae (1) и F. cul-morum (2).
вого потока 150 Вт/м2 (толщина освещаемого слоя - 3 мм).
Кинетику связывания протопорфирина IX с конидиями оценивали по увеличению интенсивности флуоресценции порфирина (А,возб = 415 нм, А,рег = 635 нм) после его введения (5-10-7 М) в суспензию гидратированных спор, находившуюся в измерительной ячейке флуоримет-ра. Для определения количества связываемых с конидиями молекул протопорфирина IX 2 мл суспензии спор инкубировали с порфирином (4-10-6 М) в течение 30 мин пр и 20°C. Конидии отмывали центрифугированием от несвязавше-гося красителя, осадок переводили в 1,5 н Н Cl и определяли содер жание в нем пр отопор фи-рина IX по интенсивности флуоресценции (А,возб = 405 нм, А,рег = 602 нм) и калибровочной кривой для раствора протопорфирина IX в Н Cl.
Фотосенсибилизируемое повреждение белков конидий определяли по уменьшению интенсивности флуоресценции белковых трипто-фанилов (А,возб = 280 нм, А,рег = 335 нм), пере-кисное окисление липидов - по накоплению в суспензии продуктов, реагирующих с тиобар-битуровой кислотой (ТБК) [11]. Барьер ные свойства мембран конидий оценивали по связыванию ими флуоресцентного зонда мероциа-нина. О связывании красителя судили по увеличению интенсивности его флуоресценции (А,возб = 575 нм, А,рег = 600 нм) после добавления зонда в концентрации 5-10-7 М в суспензию конидий.
Для прорастания споры переводили в жидкую среду Чапека и выдерживали при 24°C в течение 20 ч в темноте в стерильных условиях. Прор астание спор определяли с использованием световой микроскопии и количественно ха-
/фл, отн. ед.
0.2
0.0-'-'-<-■
50 100 150 200
Доза, кДж / м2
Рис. 2. Зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции суспензий конидий F. poae (1,2 -кружки и квадраты соответственно) и F. culmorum (3,4 - треугольники и ромбы соответственно) от дозы освещения в присутствии 1-10"6 М (1,3) и 4-10"6 М (2,4) протопорфирина IX.
рактеризовали по пр оцентному содер жанию конидий, образовавших ростовые тр убки.
Спектр офлуориметрические измерения пр о-водили на спектрофлуориметре SOLAR СМ 2203 (Беларусь), фотометрические - на фотометр е SPEKOL 11 (Гер мания).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы обнаружили связывание протопорфирина IX с конидиями грибов рода Fusarium , что проявляется в увеличении интенсивности флуоресценции и длинноволновом сдвиге максимумов в спектрах возбуждения и флуоресценции красителя в присутствии спор [12]. На рис. 1 приведены кинетики увеличения интенсивности флуоресценции протопорфирина IX при его введении в суспензии спор. Как видно, динамическое равновесие в распределении красителя между средой и конидиями устанавливается примерно через 30 мин инкубации при комнатной температуре. К этому времени со спор ами связывается 0,61 ± 0,04 и 1,04 ± 0,06 нмоль молекул порфирина на 106 спор F. poae и F. culmorum соответственно.
Связывание протопорфирина IX с конидиями создает условия для фотосенсибилизирован-ного порфир ином окисления компонентов спор генерируемыми при о свещении синглетным кислородом и свободными радикалами. На рис. 2 представлены зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции суспензий спор, инкубированных в присутствии протопорфири-на IX, от дозы освещения. Видно, что освещение приводит к снижению интенсивности флуоресценции конидий, что свидетельствует о разру-
СЕНСИБИЛИЗИРУЕМЫЕ П РОТОПОРФИРИНОМ IX ФОТОПОВРЕЖДЕНИЯ 799
о
НО 50 100 150 200
Доза, кДж / м2
Рис. 3. Зависимости содержания ТБК-активных продуктов в суспензиях конидий F. poae (1,2) и F. culmorum (3,4) от дозы освещения в присутствии 1-10-6 М (1,3) и 4-10-6 М (2,4) протопорфирина IX.
шении индольного кольца тр иптофанилов [13]. Степень повреждений зависит от дозы о свеще-ния, концентрации сенсибилизатора и вида спор. При дозе освещения 200 кДж/м2 в присутствии протопорфирина IX в концентрации 4 -10-6 М окисляется пример но 65 и 36% трип-тофанилов спор F. poae и F. culmorum соответственно. На рис. 3 приведены данные о накоплении ТБК-активных продуктов в суспензиях спор, освещенных в присутствии ПП. После освещения суспензий спор в дозе 200 кДж/м2 в присутствии 4 -10-6 М протопорфирина IX содержание продуктов окисления липидов в суспензиях конидий F. poae и F. culmorum увеличивается на 4,8 и 1,0 нмоль/106 спор соответственно. Таким обр азом, как белки, так и ли-пиды гидратированных спор грибов рода Fusarium подвергаются фотосенсибилизированно-му протопорфирином IX окислению.
Поротопорфирин IX является гидрофобным красителем, который в клетках преимущественно связывается с клеточными мембранами. Ранее на изолированных мембр анах эритроцитов мы показали, что фотосенсибилизируемое ПП окисление мембр анных белков и липидов, пр и-водит к снижению барьерной функции мембран [14], а на нативных эритроцитах обнаружили, что фотосенсибилизируемые повреждения мембран приводят к увеличению пассивной их проницаемости к амфифильному красителю меро-цианину [15]. В настоящей работе мы использовали мероцианин для оценки влияния фото-сенсибилизируемого ПП воздействия на барьерные свойства мембран гидратированных спор. Как следует из рис. 4, краситель слабо связывается с нативными конидиями. Вместе с тем связывание мероцианина с конидиями гр и-бов F. poae и F. culmorum резко увеличивается
/фл, отн. ед.
2 4 6 8 Го
t, мин
Рис. 4. Кинетики изменения интенсивности флуоресценции мероцианина 540 при введении красителя в суспензии конидиий F. poae (1,2) и F. culmorum (3,4) до (1,3) и после (2,4) освещения (200 кДж/м2) суспензий в присутствии 4 • 10-6 М протопорфирина IX.
после фотодинамического воздействия в дозах, вызывающих окисление белков и липидов спор.
Для оценки этого воздействия на жизнеспособность спор исследовали способность конидий, подвергнутых освещению в присутствии различных концентраций протопорфирина IX, к пр орастанию в питательной ср еде. Результаты проведенных исследований представлены на рис. 5. В контрольном образце после 20 ч инкубации пр и 24°С прор астает более 95% конидий F. poae и 75% - F. culmorum. Способность конидий к пр орастанию резко снижаетс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.