БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1066-1072
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.353.22
СЕЗОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ИЗОФОРМНОГО СОСТАВА ТАЙТИНА В МЫШЦАХ ЗИМНЕСПЯЩИХ СУСЛИКОВ
© 2008 г. И.М. Вихлянцев*, Е.В. Карадулева*, З.А. Подлубная* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области;
**Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области
E-mail: vikhlyantsev@iteb.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Проведено электрофоретическое исследование количественных изменений интактных форм тайтина, N2B-, N2BA-, К2Л-форм тайтина и Т2 в сердечной и скелетных мышцах сусликов Spermophillus undulatus в разные периоды: летняя активность, осенняя активность, спячка, пробуждение, зимняя активность. В предсердиях и желудочках сердца осенних активных сусликов обнаружено увеличение (в ~1,5 раза) количества N2BA-фоpмы тайтина по отношению к количеству его N2B-фоpмы в сравнении с их количественным соотношением в сердечной мышце летних активных животных. В период гибернации наблюдалось снижение количества N2B-, N2BA-фоpм тайтина и Т2 в сердечной мышце, а также N2A-фоpмы тайтина и Т2 в скелетных мышцах сусликов по отношению к количеству тяжелых цепей миозина на фоне сохранения относительного содержания интактных форм тайтина. При пробуждении суслика, а также в периоды его кратковременной активности между баутами наблюдалось быстрое восстановление количества N2B,- N2BA-, N2A-фоpм тайтина и Т2 в сердечной и скелетных мышцах. При этом в сердечной мышце спящих, пробуждающихся и зимних активных сусликов сохранялось увеличенное количественное соотношение N2BA-фоpмы тайтина к его N2B-фоpме. Обнаруженные количественные изменения разных форм тайтина обсуждаются в связи с их ролью в механизмах адаптации животных к неблагоприятным условиям зимней спячки.
Ключевые слова: зимняя спячка, интактные изоформы тайтина, N2B-, N2BA-, Ы2А-формы тайтина, фрагменты тайтина.
В природе широко распространено состояние торпидности или оцепенения, свойственное самым разным представителям животного мира. Одним из примеров торпидности является зимняя спячка или гибернация млекопитающих [1,2]. Якутские длиннохвостые суслики Брвттор-ИШш ппёпШш относятся к истинным (облигат-ным) гибернантам, для которых характерна четкая сезонная динамика перестройки метаболизма. Их спячка продолжается пять - семь месяцев и состоит из циклов (баутов) продолжительностью от 7 - 10 суток до месяца, за которыми следуют кратковременные пробуждения на период от нескольких часов до суток. При пробуждении животного переход от почти полного угнетения всех физиологических систем организма к их нормальной функциональной активности совершается очень быстро - за 2 - 3 ч без патологических последствий. Значительные изменения в этот период наблюдаются в работе сердечной мышцы. Так, в фазе повышенного термогенеза при пробуждении суслика
ТМЦ - тяжелые цепи миозина.
частота сердечных сокращений возрастает с 4 -20 до 400 ударов в минуту [3], что в два - три раза выше, чем частота сердечных сокращений у активного животного. Проведенные ранее исследования показали, что адаптационные изменения в изоформном составе легких и тяжелых цепей миозина (ТЦМ) [4-10], а также степени фосфорилирования легких цепей миозина, тай-тина и белков его семейства [9-12] сердечной и скелетных мышц суслика при гибернации вносят вклад в функциональную пластичность мышц в этот период. Недавно выявлено увеличение содержания К2Б-формы тайтина в сердечной мышце гибернирующего медведя итэт arctos ИотЫШ [13]. В наших ранних исследованиях показано увеличение количества К2БЛ-формы тайтина в левом желудочке сердца ги-бернирующих сусликов [14]. Однако эти исследования не учитывали количественных изменений при гибернации интактных изоформ тай-тина, изучение которых проведено нами недавно [15] (см. также предыдущую статью этого выпуска). Результаты наших исследований позволили сделать предположение о том, что известные К2Б-, К2БЛ- и К2Л-формы тайтина
могут быть фрагментами его интактных более высокомолекулярных изоформ.
В этой работе проведено электр о фор етиче-ское изучение количественных изменений интактных изоформ тайтина, а также N2B-, N2BA-, N2A- и Т2-фрагментов тайтина в сердечной и скелетных мышцах зимнеспящих сусликов в разные периоды: летняя активность, осенняя активность, спячка, пробуждение, зимняя активность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили зимнеспя-щие суслики Spermophillus undulatus, отловленные летом в Якутии и содержащиеся в условиях вивария в индивидуальных клетках при естественном фотопериоде. Обеспечение пищей, водой и гнездовым материалом ad libitum. Эксперименты проводили на следующих группах животных: летних активных (май-сентябрь); осенних активных (октябрь - середина ноября); гибернирующих (конец ноября - март, температура сердечной мышцы 2 - 5°С, продолжительность баута спячки 7 - 14 суток); пробуждающихся (температура сердечной мышцы 15 - 32°С, время пробуждения 1,5 - 2,5 ч) и зимних активных (активность от нескольких часов после пробуждения до двух суток). Гибернирую-щих животных содержали в темном помещении при температуре 2 - 4°С. Состояние гиберни-рующих сусликов оценивали визуально, а также по изменению температуры тела животного. Для этого суслика помещали в деревянный ящик с вмонтированным термодатчиком. С помощью этого оборудования проводили контроль за пробуждением суслика при его естественном выходе из спячки. Искусственное пробуждение животного вызывали перемещением суслика в освещенную комнату с температурой 20°С. Процесс пробуждения животного контролировали по изменению ректальной температуры тела и частоты сердечных сокращений
[16]. Для электр офоретического анализа использовали образцы скелетных (m. soleus, m. quad-псерэ femoris, m. gastroraemius, m. psoas, m. longissimus dorsi) и сердечных (предсердия, правый и левый желудочки) мышц сусликов. Использовали как свежие, так и замороженные образцы мышц, хранившиеся при температуре минус 75°С.
ДСН-электрофорез проводили по методу
[17], используя крупнопористые полиакрила-мидные с добавлением агарозы гели размером 8 х 10 см (мини-гель) и 14,5x16 см. Более подробное описание используемых методик представлено в предыдущей статье этого вы-
Интактный
4.А к ь» - 'И?: В > » лш 1 2 3 4 5
(6)
1 2 3 4 5
Рис. 1. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в левом желудочке сердца сусликов; (а) -электрофореграммы; (б) - денситограммы. Электрофорез проведен в вертикальном геле размером 8x10 см с содержанием агарозы 0,55 % и полиак-риламида 2,3 %: 1 - активный летний суслик; 2 -активный осенний суслик; 3 - гибернирующий суслик; 4 - пробудившийся суслик (2 ч после выхода из спячки); 5 - зимний активный суслик (сутки после пробуждения). Указаны белковые полосы: тяжелых цепей миозина (ТЦМ); Т2-фрагментов; Ы2Б- и Ы2БЛ-фрагментов тайтина, интактного тай-тина.
пуска. Следует отметить, что в отличие от мини-геля, гель большего размера очень непрочный, вследствие чего с ним крайне трудно проводить все необходимые манипуляции после завершения гель-электрофореза (окрашивание, отмывание, сканирование). Поэтому в нашем исследовании гели большого размера использовались редко и только для разделения в них интактных К2БЛ- и К2Б-изоформ тайтина, ко-
Таблица 1. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в левом желудочке сердца сусликов
Циклы сезонной активности сусликов
Интактный тайтин/ТЦМ
ШВА/ТЦМ
ШВ/ТЦМ
N2BA/N2B
Т2/ТЦМ
Летняя активность (май-сентябрь), п = 12
Осенняя активность (октябрь-середина ноября), п = 11
Спячка(гибернация) (конец но-ября-март), п = 22
Пробуждение (выход из спячки), п = 11
Зимняя активность (2 ч после пробуждения), п = 2
Зимняя активность (1 - 2 сут активности между баутами спячки), п = 12
0,038 ± 0,012
0,037 ± 0,013
0,044 ± 0,020
0,039 ± 0,013
0,038 ± 0,006
0,042 ± 0,008
0,014 ± 0,005
0,024 ± 0,012
0,019 ± 0,008
0,025 ± 0,009
0,033 ± 0,001*
0,033 ± 0,014
0,068 ± 0,013
0,074 ± 0,017
0,049 ± 0,016
0,056 ± 0,024
0,078 ± 0,006
0,071 ± 0,020
0,195 ± 0,084
0,295 ± 0,085
0,385 ± 0,114
0,449 ± 0,097
0,432 ± 0,040*
0,442 ± 0,092
0,024 ± 0,009
0,039 ± 0,014
0,018 ± 0,009
0,025 ± 0,010
0,027 ± 0,001
0,031 ± 0,009
Примечание: * - Уровень значимости p < 0,05; сравнение с группой летних активных сусликов, ТЦМ - тяжелые цепи миозина.
торые в мини-гелях не разделяются. Денсито-метрическую обработку гелей проводили с помощью компьютерной программы Total Lab 1.11. Количество тайтина оценивали по отношению к количеству тяжелых цепей миозина. В табл. 1-5 приведены средние арифметические величины соотношений интегральных плотностей соответствующих белковых полос на гелях и их стандартные ошибки. Статистическую обработку проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При использовании мини-гелей, в предсердиях и желудочках сердца осенних активных сусликов выявлено увеличение (в ~1,5 раза) количества К2БЛ-фрагмента тайтина по отношению к количеству К2Б-фрагмента тайтина в сравнении с их количественным соотношением в сердце летних активных сусликов (табл. 1-3, рис. 1, дорожки 1,2). Используя гели большего размера, мы обнаружили, что количественное соотношение интактных К2БЛ- и К2Б-изоформ тайтина равно количественному соотношению
Таблица 2. Сезонные изменения изоформного состава тайтина в предсердиях сусликов
Циклы сезонной активности сусликов
Интактный тайтин/ТЦМ
ШВА/ТЦМ
ШВ/ТЦМ
N2BA/N2B
Т2/ТЦМ
Летняя активность (май-сентябрь), п = 5
Осенняя активность (октябрь-середина ноября), п = 5
Спячка (гибернация) (конец ноября-март), п = 10
Пробуждение (выход из спячки), п = 7
Зимняя активность (2 ч после пробуждения), п = 2
Зимняя активность (1 - 2 сут активности между баутами спячки), п = 10
0,031 ± 0,015
0,036 ± 0,011
0,032 ± 0,018
0,028 ± 0,013
0,027 ± 0,004
0,034 ± 0,015
0,040 ± 0,017
0,042 ± 0,003
0,034 ± 0,017
0,039 ± 0,017
0,040 ± 0,005
0,054 ± 0,021
0,062 ± 0,027
0,055 ± 0,008
0,039 ± 0,019
0,046 ± 0,019
0,043 ± 0,002
0,060 ± 0,023
0,634 ± 0,104
0,776 ± 0,096
0,878 ± 0,1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.