МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 1033-1040
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.217.34
ЧАСТЬ МАТРИЦЫ С 5'-СТОРОНЫ ОТ КОДОНА В Е-УЧАСТКЕ СБЛИЖЕНА С БЕЛКОМ S26 НА 80S РИБОСОМЕ ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. М. В. Молотков, Д. М. Грайфер, А. В. Еремина, А. В. Иванов, Е. С. Лалетина, М. Н. Репкова, А. Г. Веньяминова, Г. Г. Карпова*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии
наук, Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 17.11.2003 г.
Изучено окружение части матрицы с 5'-стороны от кодона в Е-участке 80S рибосомы с помощью производных нона- и додекарибонуклеотидов, содержащих фенилаланиновый кодон UUU на 3'-кон-це, с перфторарилазидогруппой на первом или третьем нуклеотиде. Использовали два набора аналогов мРНК - с фотоактивируемыми группами, присоединенными по атому С5 остатков уридина и по атому N7 остатков гуанозина. Аналоги мРНК располагали на 80S рибосомах с помощью связывания в Р-участке тРНКРЬе, узнающей кодон UUU, благодаря чему нуклеотид со сшивающей группой оказывался в положениях от -4 до -9 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке. Облучение комплексов рибосом с тРНКРЬе и аналогами мРНК мягким УФ-светом приводило к сшивке последних преимущественно с 40S субчастицами, а в ее составе - практически только с белками. Основной мишенью модификации во всех случаях был белок S26. При расположении сшивающей группы на нуклеотиде в положении -4 происходила также в небольшой степени сшивка с белком S3, а в положении -6 - с белком S14. В отсутствие тРНК все аналоги мРНК сшивались с белком S3.
Ключевые слова: 80S рибосома, фотосшивки, аналог мРНК, рибосомные белки, эукариоты.
PART OF mRNA UPSTREAM THE E SITE BOUND CODON IS CLOSE TO PROTEIN S26 ON THE HUMAN 80S RIBOSOME, by M. V. МоЫкау, D. M. Graifer, A. V. Eremina, A. V. Ivanov, E. S. Laletina, M. N. Rep-kova, A. G. Ven'yaminova, G. G. Karpova* (Novosibirsk Institute of Bioorganic Chemistry, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: karpova@niboch.nsc.ru). Positioning of mRNA on the 80S ribosome upstream the E site bound codon was studied using derivatives of nona- and dode-caribonucleotides containing the triplet UUU coding for Phe at the 3'-terminus, and a perfluorophenylazide cross-linker on either the first or the third nucleotide. Two sets of the mRNA analogues were used, with the photoactivatable groups on either the C5 atom of the uridine or the N7 atom of the guanosine. The modified nucleotides were directed to positions from -4 to -9 with respect to the first nucleotide of the P site bound codon by tRNAPhe cognate to the triplet UUU targeted to the P site. Mild UV-irradiation of ribosome complexes with tRNAPhe and mRNA analogues resulted in the cross-linking to the 40S subunits preferentially, mainly to the proteins. The principal target for the cross-linking was protein S26 in all cases. Location of the photoacti-vatable group on the nucleotide at position -4 lead also to the minor cross-linking to protein S3, and at position -6 to protein S14. In the absence of tRNA, all mRNA analogues cross-linked to protein S3.
В последнее время достигнуты впечатляющие успехи в расшифровке структуры прокариотиче-ской рибосомы и ее комплексов с тРНК и мРНК, благодаря чему стало возможным получить на атомном уровне представление о рибосомных компонентах, соседствующих с нуклеотидами матрицы в положениях от -15 до +16 относительно первого нуклеотида кодона в Р-участке [1, 2]. По данным работы [1] матрица на рибосоме контактирует в основном с 16Б рРНК, за исключением декодирующего центра, участков "входа" в рибосому и "выхода" из нее, и районов, контактирующих с несколькими нуклеотидами с 5'-стороны от кодона в Е-участке и с 3'-стороны от кодона в
* Эл. почта: karpova@niboch.nsc.ru
А-участке, где она сближена также с белками. К настоящему времени с помощью метода аффинного химического сшивания накоплено также много данных о расположении кодонов матрицы в А, Р и E-участках рибосом человека. В частности, использование фотоактивируемых аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов, позволило получить информацию о нуклеотидах 18S рРНК и белках, сближенных с нуклеотидами матрицы в положениях от -3 до +6 [3-6]. В то же время, область 80S рибосомы, где происходит связывание части матрицы, расположенной с 5'-стороны от кодона в E-участке, остается малоизученной. Однако именно в этой области происходят взаимодействия, необходимые для правильной ориентации на рибосоме значительной части матрицы,
Аналоги мРНК, использованные для аффинной модификации рибосом человека, и положение модифицированных нуклеотидов относительно первого нуклео-тида кодона иии в Р-участке
Аналог мPHK Hyклeотидная последовательность аналога мPHK Положение модифицированного нуклеотида
I pCUG* UCA UUU -4
II рG*UA UCA UUU -б
III рG*UA UCU CUC UUU -9
IV pUCU* GUG UUU -4
V pU*CU GUG UUU -б
VI рU*CU CUC GUG UUU -9
* Модифицированные нуклеотиды, структура которых приведена на рис. 1.
нефиксированной связыванием с тРНК. Полученные ранее данные позволяют предположить, что в отличие от рибосом прокариот в формировании этой области рибосом млекопитающих принимают участие преимущественно рибосом-ные белки. Так, при модификации 80S рибосом человека алкилирующими производными олиго-рибонуклеотидов относительная доля модификации белков резко возрастала и достигала 85% при смещении нуклеотида с модифицирующей группой из положения +1 в положение -6 [7]. Недавно были определены белки, контактирующие с гло-биновой мРНК, в 40S комплексе инициации [8].
F F ÇH2NH-ÇO—^—N3 F F
G* :
çh3nçh2çh2 o \ "
+ N-<
n^n^nh2
rib
NH
A
O
U*
F F
-NHCH2ÇH2NH-ÇO^ V- N3
T F F
rib
HN
Л
Рис. 1. Структурные формулы модифицированных остатков уридина и гуанозина в составе фотоактиви-руемых аналогов мРНК, использованных в данной работе.
Однако результаты этой работы, в которой использовали PHK-транскрипты с остатками 4-тио-уридина, статистически распределенными по всей молекуле, не дают информации о том, с какими нуклеотидами мPHK контактируют данные белки.
В настоящей работе изучено расположение на SCS рибосоме человека нуклеотидов матрицы в положениях от -4 до -9. С этой целью использовали производные нона- и додекарибонуклеоти-дов, содержащих фенилаланиновый кодон UUU, с 4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоильной группой, присоединенной через различные спейсеры к атому С5 остатка уридина или N7 остатка гуано-зина в первом или третьем положении.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали тPHKPhe (13CC пмоль/ОЕ^) Escherichia coli, любезно предоставленную Т.Г. Шапкиной (СПИЯФ PAH, г. Гатчина).
Синтeз пpoизвoдныx oлигopибoнyклeoтидoв,
несущих 2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-аминоэтильную группу на атоме С5 остатка ури-дина в четвертом, пятом или шестом положении, их выделение и подтверждение структуры проводили, как описано ранее [9].
Oлигopибoнyклeoтиды, co;iepÊ;uune ocтaтoк гyaнoзинa в первом или третьем положении, синтезировали согласно [1C].
Фoтoaктивиpyeмыe пpoизвoдныe oлигopибo-нyклeoтидoв, несущие 4-азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензоильную группу, присоединенную к атому N7 остатка гуанозина через 4-(^2-хлорэтил-^метила-мино)бензиламидный спейсер (аналоги I-III, см. таблицу и рис. 1), получали, как описано ранее [4].
Meчeниe пpoизвoдныx oлигopибoнyклeoтидoв
по 5'-концу с помощью [y-32P]ATP и выделение меченого продукта проводили по методике [11].
40S и 60S pибocoмныe cyбчacтицы выдeляли
согласно [12].
Для пoлyчeния SOS pибocoм субчастицы реактивировали в буфере А, содержащем 2C yM Трис-HCl, pH 7.5, 12C мM KCl, 13 мМ MgCl2, C.6 мM EDTA, при 37°С в течение 1C мин и смешивали в мольном соотношении 4CS : 6CS = 1 : 1.3. Активность рибосом в поли^^зависимом связывании [14C]Phe-тPHKPhe составляла 7C% (максимальная степень связывания 1.4 моль Phe^PHK^ на моль SCS рибосом).
Koмплeкcы pi-moc'cmi c aнaлoгaми мРНК пoлy-чaли, инкубируя SCS рибосомы (конечная концентрация 7 x 1C-7 M) с 5'-32P-мeчeными аналогами мPHK (2 x 1C-6 M) и тPHKPhe (3 x 1C-6 M) в буфере А при 20°C в течение 5C мин. Степень связывания аналогов мPHK с рибосомами определяли фильтрацией через нитроцеллюлозные фильтры [4].
Облучение комплексов рибосом с аналогами мРНК проводили, как описано в [13].
Распределение радиоактивной метки между рРНК и белками в составе модифицированных 80S рибосом анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS), как описано ранее [14]. Рибосомы предварительно осаждали 0.7 объема охлажденного этанола, центрифугировали, осадки растворяли в буфере, содержащем 1%-ный SDS, 10 мМ EDTA, рН 7.5 и 0.5%-ный 2-мер-каптоэтанол, и инкубировали 20 мин при 37°С. Гель радиоавтографировали, пятна, соответствующие аналогу мРНК и модифицированным белкам, вырезали и просчитывали по Черенкову. Долю аналога мРНК, которая расходуется на сшивку с белками, рассчитывали, зная удельную активность аналога мРНК и принимая во внимание степень его связывания с 80S рибосомами.
Диссоциацию модифицированных рибосом на субчастицы проводили, как описано ранее [15].
Распределение радиоактивной метки между рРНК и белками в составе 40S субчастиц анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS, как описано выше для 80S рибосом.
Белки из модифицированных 40S субчастиц выделяли с помощью экстракции 66%-ной уксусной кислотой с последующим осаждением ацетоном [12].
Двумерный электрофорез белков, выделенных из модифицированных 40S субчастиц, проводили после гидролиза пришитого остатка гекса-рибонуклеотида РНКазой А [16, 17] (разделение в первом направлении проводили в слабощелочной среде, а во втором - в слабокислой среде в присутствии SDS). Для идентификации модифицированных белков радиоавтографы накладывали на соответствующие окрашенные гели и определяли положения радиоактивных пятен относительно окрашенных белков, при этом учитывали результаты одномерного разделения.
Белок S26 определяли с помощью иммунобло-тинга после одномерного разделения белков
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.