ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22+574.522+579.8
ЧИСЛЕННОСТЬ И РАЗНООБРАЗИЕ МЕТАНОТРОФНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОАММЛРЮТЕОБЛСТЕЯМ В СЕВЕРНЫХ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ © 2014 г. О. В. Данилова, С. Н. Дедыш1
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 30.07.2013 г.
Настоящая работа посвящена оценке численности, молекулярной идентификации и выяснении рН предпочтений метанотрофных представителей Оаттарго(еоЬас(епа (метанотрофов I типа), населяющих северные кислые болотные экосистемы. Активность окисления метана образцами торфа шести болотных массивов Европейского севера России (рН 3.9—4.7) варьировала в диапазоне 0.04—0.60 мкг СН4 г-1 торфа ч-1. Численность клеток, выявленных гибридизацией с флуоресцентно-мечеными зондами М84 + М705, специфичными для метанотрофов I типа, составила 0.05-2.16 х 105 клеток г-1 сырого торфа, что соответствовало 0.4-12.5% от общего числа метанотрофов или 0.004-0.39% от общей численности бактерий. Анализ фрагментов гена ртоА, кодирующего мембранную метанмонооксиге-назу, показал преобладание представителей рода Ме1Ьу\осувИв (92% всех клонов) в исследованном образце кислого торфа, в то время как доля последовательностей ртоА метанотрофов I типа была незначительной (8%). ПЦР-амплификация фрагментов генов 168 рРНК метанотрофов I типа с праймерами ТуреШ-ТуреШ оказалась малоспецифичной, так как лишь три клонированные последовательности из 53-х проанализированных принадлежали метанотрофам и обнаруживали 93-99% сходства с таковыми у представителей родов Ме^у1ош1ыт, Ме^уЬтопав и МеМуЪЬаМег. Полученные из торфа изоляты метанотрофов I типа, штаммы 8Н10 и 83А5, были идентифицированы в качестве представителей видов Ме^уЬтопав раЫ^в и Ме^у1от1ыт т1уакопепве. Из них, к росту в кислых средах был способен лишь Ме^уЬтопавраЫ^в 8Н10 (рН диапазон роста 3.8-7.2, оптимум 5.86.2), тогда как МеМуЬуыЫт т1уакопепве 83А5 проявлял ростовые характеристики, типичные для нейтрофильных метанотрофов (рН диапазон роста 5.5-8.0, оптимум 6.5-7.5).
Ключевые слова: северные болотные экосистемы, метанотрофные бактерии, флуоресцентная т вйы-гибридизация, Оаттарго(еоЬас(епа, Ме^уЬтопав, Ме(ку1оуы1ыт.
DOI: 10.7868/S0026365614020049
Северные болотные экосистемы являются одним из крупнейших природных источников парникового газа метана [1]. Эмиссия метана из болот в атмосферу контролируется аэробными метано-трофными бактериями, населяющими верхние слои болотного профиля. Исследования последних полутора десятков лет позволили установить, что основным компонентом "метанокисляющего фильтра" кислых северных болот являются метанотрофные представители Alphaproteobacteria (ме-танотрофы II типа), относящиеся к семействам Methylocystaceae и Beijerinckiaceae [2—4]. Выделенные из болот метанотрофы родов Methylocystis, Methylocapsa, Methylocella и Methyloferula были охарактеризованы как умеренно ацидофильные организмы, способные окислять метан в кислых и холодных условиях [5—9].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dedysh@mail.ru).
До сих пор, однако, остается дискуссионным вопрос о присутствии в кислых болотах и вкладе в окисление СН4 метанотрофных представителей Gammaproteobacteria (метанотрофов I типа). По данным анализа кислых торфов с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), метанотрофы I типа в них немногочисленны и составляют не более нескольких процентов от общей численности метанотрофных бактерий [2, 10]. Тем не менее, нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК иpmoA, обнаруживающие сходство с таковыми у представителей родов Methylobacter и Methylomonas, были неоднократно выявлены в экстрактах тотальной ДНК, полученных из сфагнового торфа [3, 11—14]. Так как до недавнего времени среди метанотрофов I типа ацидофилов известно не было, интерпретация факта их выявления в кислых болотах молекулярными методами оставалась затруднительной. Первый аргумент в пользу существования ацидофильных метанотро-
фов I типа был получен голландскими исследователями, выделившими два штамма Methylomonas-и Methylovulum-подобных бактерий из кислого торфа [15]. Эти изоляты, к сожалению, были лишь частично охарактеризованы. Недавно выделенный из сфагновых болот и описанный нами первый ацидотолерантный представитель рода Methylomo-nas, M. paludis, хотя и способен расти при рН 3.8— 5.0, но имеет оптимум роста при рН 5.8—6.4 [16], что ставит под сомнение вклад подобных организмов в процессы окисления СН4 в болотах.
Настоящая работа была предпринята для прояснения вопроса о численности и видовом составе ме-танотрофов I типа в кислых сфагновых болотах. Мы ставили также задачу получения репрезентативных изолятов этих бактерий и экспериментальной проверки их рН предпочтений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований. В работе использовали образцы торфа, отобранные в июне-июле 2011— 2012 г. на границе аэробной и анаэробной зон (глубина 5—10 см) профилей болотных массивов Шумново и Тарлаковский мох Тверской области, болота Обуховское Ярославской области, а также трех болот Архангельской области — Шоля, Солза и Цигломень (таблица). Объекты исследования представляли собой типичные верховые олиго-трофные болота бореальной и тундровой зон России, с величиной рН болотной воды 3.9—4.2. Болото Шумново граничило с участком горелого леса, что привело к повышению рН болотной воды до величины 4.7 за счет внесения зольного компонента. Отобранные образцы транспортировали в лабораторию в пакетах с охлаждением и немедленно использовали для определения метанокис-ляющей активности торфа, а также фиксации для последующего анализа методом FISH и экстракции ДНК для молекулярных исследований.
Определение скорости окисления метана образцами торфа. Навески по 10 г сырого торфа измельчали до фрагментов размерами 10—15 мм, помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 160 мл, герметично закрывали флаконы и вводили метан до концентрации около 1000 ppm. Флаконы инкубировали при комнатной температуре. В периодически отбираемых из газовой фазы флаконов пробах (0.5 мл) определяли концентрацию метана на хроматографе Кристалл 5000 ("ЗАО Хроматек", Россия) с пламенно-ионизационным детектором. Измерения проводили до полного исчезновения метана во флаконах. На основании полученных данных рассчитывали скорость окисления метана исследуемыми образцами торфа.
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). К
2 г сырого торфа добавляли 10—20 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали в гомо-
генизаторе в течение 10 мин. 0.5 мл полученной суспензии фиксировали с использованием 4%-ого раствора формальдегида в фосфатном буфере (NaCl - 8.0 г, KCl - 0.2 г, Na2HPO4 - 1.44 г, NaH2PO4 - 0.2 г, H2O - 1 л, pH 7.0) в течение 1.5 ч. Образец осаждали и промывали фосфатным буфером. Фиксированные образцы ресуспендиро-вали в растворе 100% этанола и фосфатного буфера (1 : 1, об : об) и до анализа хранили при -20°С. 1-2 мкл суспензии фиксированных образцов наносили на стекла с окошками и проводили гибридизацию с зондами в соответствии с методикой [17] при 46°С. Учет численности клеток метано-трофов I типа осуществляли путем гибридизации с эквимолярной смесью СуЗ-меченых зондов М705 + М84, а метанотрофов II типа - с зондом М450 [18]. Общую численность клеток бактерий определяли гибридизацией с эквимолярной смесью зондов Eub338-mix [19]. Синтез зондов, меченных флуоресцентным красителем Cy3, осуществлялся компанией "Синтол" (Москва, Россия). Препараты анализировали с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 ("Carl Zeiss", Германия) со светофильтрами Zeiss 20 для Су3-меченных зондов и Zeiss 02 для выявления автофлуоресценции клеток.
Оценка разнообразия метанотрофов в торфе путем ПЦР-анализа геновpmoA и 16S рРНК. Выделение тотальной ДНК из торфа производили с использованием набора "FastDNA SPIN kit for soil" ("Biol 101", США) в соответствии с рекомендацией производителя. Полученную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оценку общего разнообразия мета-нотрофных бактерий в торфе проводили путем ПЦР-амплификации фрагментов гена pmoA, кодирующего полипептид, несущий активный центр мембраной метанмонооксигеназы (мММО), для чего использовали праймеры А189f и А682г [20]. Разнообразие метанотрофных представителей Gam-maproteobacteria в исследуемых образцах определяли с помощью праймерных систем typeIF-typeIR и MethT1dF-MethT1bR, специфично амплифициру-ющих фрагменты (~660 и 900 пар нуклеотидов соответственно) генов 16S рРНК метанотрофов I типа [21, 22]. В качестве положительного контроля использовали ДНК метанотрофной бактерии Methy-lomonaspaludis MG30'r. ПЦР проводили на термо-циклере PE GeneAmp PCR System 9700 ("Perkin-Elmer Applied Biosystems", США). Проверку продуктов ПЦР осуществляли путем их электрофореза в 1.2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией продуктов реакции с помощью УФ-тран-силлюминатора. Полученные ампликоны были клонированы с помощью набора "pGem-T Easy Vector System II" ("Promega") в соответствии с рекомендацией фирмы-производителя. Отбор ре-комбинантных клонов осуществляли путем ам-
Активность окисления метана и численность метанотрофов в исследованных болотных экосистемах
Болото, расположение, время отбора образцов pH Трофность болота Состав растительности Активность окисления метана торфом, мкг СН4 г-1 ч-1 Число клеток, выявленных гибридизацией с зондами на бактерий (ЕиВ338-гшх) и метанотрофов I (М705 + М84) и II (М450) типов, г-1 сырого торфа
EUB338-mix (TVx 108) М705 + М84 (TVx 105) М450 (TVx 106)
Солза, Архангельская обл., N 64°48', Е 39°56' 07.2012 3.9 Олиготрофное Sphagnum fuscum, Eriophorum latifolium, Drosera rotundifolia, Oxycoccuspalustris, Vaccinium uliginosum, Rubus chamaemorus, Carex spp., Pinus silvestris 0.25 4.09 ± 1.53 0.96 ±0.32 2.02 ± 1.54
Цигломень, Архангельская обл., N 64°52', Е 40°32' 07.2012 3.9 Олиготрофное Sph. fuscum, E. latifolium, D. rotundifolia, Empetrum nigrum, O. palustris, V. myrtillus, V. uliginosum, R. chamaemorus, Carex spp., Andromeda polifolia, Betula pendula 0.47 0.64 ±0.10 0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.