ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 241-245
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 631.46:579.8.044
ЧИСЛЕННОСТЬ, ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И РАЗНООБРАЗИЕ ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ ПРОКАРИОТ В СФАГНОВОМ ВЕРХОВОМ ТОРФЯНИКЕ © 2014 г. Л. В. Лысак, Е. В. Лапыгина, М.С. Кадулин, И.А. Конова
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ф-т почвоведения, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр.12 E-mail: lvlysak@mail.ru Поступила в редакцию 03.05.2012 г.
Определены численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие (на уровне филумов) фильтрующихся форм прокариот (ФФП) в основных генетических горизонтах верхового торфяника. Отмечено, что численность ФФП достигает 500 млн клеток в 1 г, т.е. до 5% числа бактерий обычного размера, а доля жизнеспособных клеток среди ФФП (93—98%) выше этого же показателя для бактерий обычного размера (60—68%). С помощью метода FISH (fluorescence in situ hybridization) показано, что среди ФФП обнаружены те же филогенетические группы (домен Archaea и филумы Actinobacteria, Cytophaga и Proteobacteria домена Bacteria), что и среди бактерий обычного размера.
DOI: 10.7868/S0002332914030084
Сведений о бактериальных сообществах сфагновых торфяников немного, и касаются они в основном определения численности и биомассы бактерий прямым микроскопическим методом с помощью окраски почвенной суспензии акридином оранжевым (Головченко и др., 2007), а также таксономической структуры бактериального комплекса методом посева на агаризованные среды (Добровольская и др., 2007). Известны результаты обнаружения отдельных филогенетических групп бактерий с помощью метода FISH (fluorescence in situ hybridization): метанотрофных бактерий (Kotsyurbenko et al., 2007), метаногенных ар-хей (Horn et al., 2003) и некоторых других групп бактерий (Sizova et al., 2003; Панкратов и др., 2005; Dedysh et al., 2007). При этом жизнеспособности и размерам клеток бактерий уделяется значительно меньше внимания.
С помощью окраски почвенной суспензии красителем L7012 (LIVE/DEAD..., 2004) ранее нами было показано, что численность потенциально жизнеспособных клеток в почве in situ составляет ~60% числа всех клеток, выявляемых прямым микроскопическим методом (Лысак и др., 2009, 2010). Это позволяет по-новому взглянуть на проблему физиологического состояния бактерий в почве.
Известно, что одна из форм существования бактерий в природных средах — мелкие бактерии (наноформы, ультрамикробактерии, фильтрующиеся формы, "карликовые формы", ультрамик-роклетки и др.). Такие формы обнаружены во многих природных субстратах прямыми микро-
скопическими методами (Никитин, 1964; Ананьева, Никитин, 1979; Morita, 1988; Мишустина, Калюжная, 1987; Kajander, Ciftcioglu, 1998; Folk, 1999; Panikov, 2005; Дуда и др., 2012). Однако численность, жизнеспособность, таксономическая принадлежность и экологические функции мелких форм бактерий в почве остаются пока малоизученными.
Цель работы — изучение численности, жизнеспособности и таксономической принадлежности фильтрующихся форм прокариот (на уровне филумов) в сфагновом верховом торфянике.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили образцы монолита верхового торфяника, отобранного на территории Западно-Двинского лесоболотного стационара Института лесоведения РАН (Тверская обл.). Растительность — сосняк андромедо-во-пушицево-сфагновый. Образцы были отобраны в октябре 2007 г. и анализировались в лаборатории в течение месяца после отбора. Изучались образцы из следующих горизонтов верхового торфяника: очеса мха, ТО (6—10 см), Т1 и Т2 (10—14 и 14—30 см соответственно).
Для обнаружения фильтрующихся форм прокариот (ФФП) в исследованных образцах была использована методика, включавшая в себя выделение бактериального комплекса из почвенной суспензии с дальнейшей фильтрацией проб через ядерные мембранные фильтры (Sarstеdt, Германия) с размером пор 0.22 мкм (220 нм) и концен-
Таблица 1. Общая численность и жизнеспособность бактерий обычного размера и ФФП в горизонтах верхового торфяника (млрд клеток в 1 г, окраска Ь 7012)
Почва Горизонт Общая численность бактерий ФФП Доля ФФП в общей численности бактерий
Верховой торфяник T0 5 . 8 ± 0 .5 60 0 . 3 ± 0 .01 95 5.2
T1 1 3 .3 ± 0.9 68 0 . 5 ± 0 .02 98 3.8
T2 6 . 0 ± 0 .5 67 0 . 1 ± 0 .01 93 1.7
Примечание. В числителе — общая численность бактерий и ФФП; в знаменателе — доля жизнеспособных клеток, %; ФФП — фильтрующиеся формы прокариот, для табл. 1 и 2.
трированием полученного фильтрата центрифугированием. Навеску почвы (1 г) помещали в 100 мл стерильной воды, обрабатывали для десорбции клеток с поверхности частиц на приборе УДЗН-1 (Россия) при следующем режиме: 22 кгц, 0.44 А, 2 мин. Почвенные частицы осаждали центрифугированием (10 мин, 2 тыс об./мин). Надосадоч-ную жидкость набирали медицинским стерильным шприцем и фильтром-насадкой, пропускали через мембранный фильтр (Ва^её!) с размером пор 0.22 мкм, затем концентрировали полученный фильтрат центрифугированием (10 мин, 8 тыс об./мин). Диаметр подавляющей части клеток, полученных по такой методике, составлял 120—200 нм, длина не более 400 нм, что было отмечено при изучении их морфологии и размеров в просвечивающем электронном микроскопе (Соина и др., 2012).
Общую численность бактерий, численность и долю ФФП в общей численности бактерий, потенциальную жизнеспособность бактерий клеток (долю клеток с неповрежденной клеточной мембраной) определяли с помощью флуоресцентного двухкомпонентного красителя L7012 (LIVE/DEAD..., 2004) в соответствии с рекомендациями производителя с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Германия). Численность бактерий в 1 г почвы рассчитывали по общепринятой методике, используемой при работе с акридином оранжевым (Методы..., 1991).
Таксономический состав на уровне доменов и филумов определяли молекулярно-биологиче-ским методом FISH с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными маркерами, меченными флуоресцентными красителями. В ходе работы были использованы зонды, специфичные для таксонов Archaea (Arch915), Actinobacteria (HGC69a), Cytophaga (CF319a), Alphaproteobacteria (ALF1b), Betaproteobacteria (BET42a), Gammaproteobacteria (GAM42a). Подготовку препаратов, гибридиза-
цию с зондами и докрашивание проводили по ранее описанным методикам (Манучарова, 2008; Лысак и др., 2010). Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 09 для L7012 и Filter set 15 для зондов. Подсчет окрашенных клеток исследуемых филогенетических групп и последующий пересчет численности на 1 г почвы проводили так же, как и при работе с акридином оранжевым (Методы..., 1991). Подсчитывали также долю отдельных таксонов (% общего числа всех идентифицированных клеток).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Общая численность бактерий в исследованных образцах верхового торфяника варьировала от 5.8 до 13.3 млрд в 1 г субстрата (табл. 1). Максимальные значения численности бактерий были отмечены в горизонте Т1 (13.3 млрд в 1 г), минимальные — в горизонтах Т0 и Т2 (5.8 и 6.0 млрд в 1 г соответственно). Результаты определения общей численности бактерий в образцах верхового торфяника с помощью окраски L7012 совпадают с данными других авторов (Головченко и др., 2007), полученными при окраске почвенной суспензии акридином оранжевым, традиционно применяющимся в почвенной микробиологии для определения численности бактерий. Численность потенциально жизнеспособных клеток (окраска L7012) колебалась по профилю и составляла 3.5—9 млрд клеток в 1 г субстрата. При этом максимальные значения показателей также были зарегистрированы в горизонте Т1. В горизонтах Т0 и Т2 жизнеспособных клеток было меньше (3.5—4 млрд клеток в 1 г соответственно). Доля жизнеспособных клеток в исследованных горизонтах составляла 60—68% числа всех клеток.
Эти результаты совпадают с ранее полученными данными о доле жизнеспособных клеток в дерново-подзолистой почве и выщелоченном
Таблица 2. Таксономический состав бактерий обычного размера и ФФП в верховом торфянике (доля, %)
Объект Горизонт Archaea Actinobacteria Cytophaga Proteobacteria
Бактерии Т0 26 22 19 33
обычного Т1 38 12 10 40
размера Т2 29 29 12 30
ФФП Т0 14 25 25 36
Т1 23 29 18 30
Т2 26 26 20 28
черноземе, где она составляла в верхних горизонтах почв ~60% числа всех клеток (Лысак и др., 2007, 2009). Следует отметить, что вниз по профилю в черноземе и дерново-подзолистой почве доля жизнеспособных клеток в нижних горизонтах значительно снижалась, целостность мембран сохраняли 20—30% клеток, что, по всей видимости, связано с негативным действием различных экологических факторов. Стабильное соотношение жизнеспособных клеток и клеток с нарушенной мембраной по всему профилю верхового торфяника объясняется, вероятно, постоянной влажностью и высоким содержанием органического вещества.
Численность ФФП в разных горизонтах верхового торфяника варьировала от 100 до 500 млн клеток в 1 г субстрата, что ниже численности бактерий обычного размера более чем на порядок (табл. 1). Обращает на себя внимание тот факт, что ФФП были обнаружены во всех исследованных горизонтах верхового торфяника, их численность достигала сотен миллионов клеток в 1 г субстрата, при этом доля ФФП составляла в разных горизонтах от 1.7 до 5.2% общей численности бактерий.
Вертикальное распределение фильтрующихся форм по профилю верхового торфяника имело тот же характер, что и распределение бактерий обычного размера. Максимальные значения численности были зарегистрированы в горизонте Т1 (табл. 1). Однако доля их в общей численности была максимальной в горизонте Т0.
Изучение жизнеспособности ФФП в исследованных образцах верхового торфяника позволило констатировать, что практически все выявленные этим методом клетки ФФ (93—98%) имели неповрежденную клеточную мембрану. Среди бактерий обычного размера доля жизнеспособных клеток была значительно ниже и не превышала 68%.
Результаты, свидетельствующие о высокой доле клеток с неповрежденной клеточной мембраной среди ФФП, позволяют предположить их значительную жизнеспособность и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.