БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 981-989
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 541.11
ЧИСЛЕННЫЙ АНАЛИЗ ТР АЕКТОР ИЙ ЧАСТИЦ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ В УСЛОВИЯХ НЕОПРЕДЕЛЕННОСТИ
© 2015 г. А.С. Писарев*, С.А. Руколайне* **, А.М. Самсонов* **, М.Г. Самсонова*
*Санкт-Петербургский политехническийуниверситет Петра Великого, 195251, Санкт-Петербург, Политехническаяул., 29; **Физико-тех нический институт им. А .Ф. Иоффе РАН, 194021, Санкт-Петербург, Политех ническая ул., 26
E-mail: т.тт$опоуа@$рЫ1и.ти Поступила в p едакцию 11.06.15 г.
Разработан метод численного анализа траекторий частиц в живых клетках, в котором тип движения частицы определяется с применением информационного критерия Akaike, а идентификация параметров модели выполняется методом взвешенных наименьших квадратов. Метод реализован в программном комплексе на языке Java и позволяет выполнять анализ траекторий в автоматическом режиме. Метод апробирован на синтетических траекториях с известными значениями параметров моделей движения, a затем применен для анализа траекторий движения репликационных комплексов в клетках, инфицированных вирусом гепатита C. Полученные результаты согласуются с известными данными о движении биологических объектов по микротрубочкам.
Ключевые слова: анализ траекторий движения, трекинг, вирус гепатита С, метод средних квадратов смещений.
В настоящее время активно развиваются количественные методы изучения внутриклеточных процессов с использованием видеоизобра -жений, которые получают при наблюдении за живыми клетками с помощью микроскопов. Тр аектор ии движения биологических объектов и частиц, извлекаемые путем процессинга таких изображений, содержат важную инфор мацию о механизмах транспорта частиц.
В большинстве случаев ха рактер движения частицы заранее неизвестен и должен быть найден путем подгонки решений модели движения к данным. Качество такой подгонки зависит от условий эксперимента - температуры ср еды, уровня вибрации и дрейфа, частоты кадров видеоизображения, времени наблюдений, числа траекторий и точности алгоритмов трекинга -локализации позиций частиц в пространстве и времени, объединения позиций в индивидуальные траектории частиц [1-5].
Для количественного описания движений частиц используют кривые зависимости средних квадратов смещений от времени. Эти кривые высоко вариабельны в силу неопределенности в локализации частиц и поэтому могут различаться даже у двух одинаково движущихся частиц [2,5]. Такая вариабельность может привести
Сокращение: HCV - вирус гепатита C.
к выбору неправильной и/или слишком сложной модели движения при решении обратной задачи. В связи с этим способность того или иного метода правильно определять тип движения частицы сначала тестир уют на синтетических траекториях с заранее известным типом движения и только потом применяют к анализу экспериментальных траекторий [6].
Несмотр я на важность изучения механизмов транспорта частиц в биологических системах, автоматические методы трекинга и определения типов и параметров движения биологических объектов до сих пор отсутствуют [6,7]. Это отчасти объясняется тем, что в настоящее время в большинстве публикаций исследуются отдельные типы моделей движения с применением методов наименьших квадратов, оптимизированных наименьших квадратов, обобщенных наименьших квадратов, оценки максимального правдоподобия, байесовского подхода к про -верке множества гипотез.
Мы разработали автоматический метод определения типа движения биологических частиц, в котором выбор наилучшей модели движения осуществляется на основе информационного критерия А1С с учетом полученных при параметрической идентификации значений взвешенных сумм квадратов остатков и показателей структурной сложности модели. Метод
реализован в прогр аммном комплексе на языке Java, апробир ован путем анализа синтетических траекторий с известным типом движения и применен к анализу траекторий движения репли-кационных комплексов вируса гепатита С (HCV).
В мире насчитывается более 160 миллионов человек, зараженных HCV, еще тр и-четыр е миллиона человек инфицируются ежегодно [8]. Инфекция часто переходит в хр оническую стадию и пр иводит к смер тельным заболеваниям печени - циррозу и гепатокарциноме. Репликация HCV в клетке происходит в со ставе реплика-ционных комплексов, ассоциированных с модифицированными мембранами. П рирода этих комплексов и их динамика до конца не ясны. Так, например, в работе [9] было показано, что в инфицированной клетке репликационные комплексы представлены двумя типами структур. Большие структуры неподвижны, а маленькие структуры совершают быстрые скачкообразные перемещения на значительные расстояния. Движение малых комплексов пр екра -щается при обработке клеток нокадазолом -агентом, деполимеризующим микротрубочки. Для того чтобы лучше понять р оль движений репликационных комплексов в жизненном цикле HCV, в этой работе мы выполнили обработку траекторий движения малых комплексов с помощью методов ср едних квадр атов смещений и ср едних по ансамблю квадр атов смещений. Были определен тип и параметры движения репликационных комплексов, произведена оценка ср едних и максимальных значений скоростей движения. Полученные значения скоро -стей движения хорошо согласуются с известными данными о движении биологических молекул и комплексов по микротрубочкам.
ЭК ОТЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ
Синтетические траектории частиц c известными моделями движения. Для оценки качества разработанных алгоритмов и программ автоматической обработки и анализа траекторий были сфор мированы синтетические траектории частиц (броуновская диффузия, направленное движение с диффузией, аномальная диффузия (субдиффузия), ограниченная диффузия).
Ошибки локализации в траекториях частиц с броуновской диффузией и траекториях с направленным движением и диффузией [10] заданы в виде белого гауссова шума. Были выбраны следующие значения коэффициента диффузии D = 0,001 мкм2/с, скорости движения V = 0,05 мкм/с и стандартного отклонения белого гауссова шума (а = 0,005 мкм) с нулевым ср едним
значением (ц = 0 мкм). Всего было сформиро -вано 10 траекторий первого и 20 траекторий второго типа. Каждая траектория включала 100 позиций частиц с временны м лагом At = 0,05 с.
Cинтетичеcкие траектории частиц при субдиффузии были сфор мированы с использованием метода FBM (fractional Brownian motion) [11,12]. Было получено 10 траекторий, каждая из которых содержала 1000 позиций частиц с временны м лагом At = 1 с и показателем субдиффузии а = 0,7. К координатам частиц был добавлен белый гауссов шум (а = 0,1 мкм) с нулевым средним значением (ц = 0 мкм).
Cинтетичеcкие траектории частиц с ограниченной диффузией были сформированы с использованием метода и программного обеспечения, разработанного в работе [13]. Были получены 10 траекторий, каждая из которых со -держала 1000 позиций частиц с временны м лагом At = 0,01 с, коэффициентом диффузии D = 0,1 мкм2/с и радиусом ограничения движения частицы Rc = 0,5 мкм. К координатам частиц был добавлен белый гауссов шум (а = 0,03 мкм) с нулевым ср едним значением (ц = 0 мкм).
Экспериментальные траектории движения репликационного комплекса HCV были взяты из работы [9]. Эти траектории были получены путем трекинга комплекса «вручную» на видеоизображениях клеток Huh-7.5 с репликоном I/NS5A-GFP-6, в котором к белку репликазы вир уса NS5 был пр ишит зеленый флуоресцентный белок.
МЕТОДЫ И МОДЕЛИ
Метод средних квадратов смещений. Cpед-ний квадрат смещения (mean square ^р1асе-ment - MSD) для временного лага lAt MSD определяется по формуле:
N -1+1
lAt
<r2>lAt =
i=1
N - l+1'
l = 1,2, ..., N,
(1)
где N - длина, равная числу соединений локальных позиций частицы в N +1) кадра х видеоизображения, At - интервал времени (лаг) между двумя последовательными кадрами; тш -расстояние между локальными позициями частицы в кадрах, разнесенных на время At, например, Г1 Аг - это расстояние между 1-й и 2-й точками в соседних кадрах, т2Аг - это расстояние между 2-й и 3-й точками в соседних кадра х; гИАг - расстояние между точками траектории,
локальные позиции которых находятся в кадра х, разнесенных на время 1Дг. Например, г1 2Дг -это расстояние между 1-й и 3-й точками тра-ектории в кадрах, разнесенных на время 2Дг, а г22Дг - р а сстояние между 2-й и 4-й точками траектории в кадрах.
Дисперсию ср еднего квадр ата смещения вычисляют по формуле
N-1+1
1(г2ш - <r2>iAt)
=
i=i
(2)
N - l
Метод средних по ансамблю квадратов смещений. Видеоизображения движущихся частиц в живых клетках содержат траектории, длина которых может варьировать от нескольких позиций до нескольких десятков и сотен позиций. В экспериментах наблюдается большое число коротких траекторий с длиной менее 100 позиций. Вычисление средних квадратов смещений в таких случаях может приводить к значительным ошибкам. Поэтому более статистически значимые результаты могут быть получены при анализе ансамбля траекторий в предположении о независимости усредняемых траекторий.
Средний по ансамблю траекторий квадрат смещения (ЕА-МББ) определяется уср еднением МББ индивидуальных траекторий ансамбля по следующей формуле:
N.
Р
(ens) = .
1
T N -n
NT
I I (4 - j2=N-IрПр. (3)
NT(N - n)
N
j=1 i=1
n = 1, ..., N - 1,
>1
где п - номер позиции в траектории, N - длина наибольшей траектории ансамбля, равная числу позиций в траектории; Гр - г-я позиция в 7-й траектории; рП* - значение МББ в позиции п, вычисленное для ]-й индивидуальной траектории.
Дисперсия оп2 определяется по фор муле:
N
I(pj - pnens))2
«2 j=1 o2 = —
Nn - 1
(4)
где Nn - число траекторий, длина которых более или равна (п + 1).
Весовой коэффициент среднего по ансамблю траекторий квадрата смещения (ЕА-МББ) определяется по формуле:
w(ens) =
1
(5)
ot
Модели движений. Для ряда моделей движения частиц существуют аналитические решения для зависимости средних квадратов смещений от времени. Приблизительная оценка предполагаемых постоянными значений коэффициентов диффузии и скоростей движения частиц может производиться в соответствии с техникой идентификации параметров моделей по экспериментальным данным [14,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.