ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 1, с. 116-119
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.152.3
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ТИХООКЕАНСКОГО КАЛЬМАРА TODARODES РАСШСШ К ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМ ИНГИБИТОРАМ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
© 2007 г. Е. В. Розенгарт, Н. Е. Басова
Представлено академиком В.Л. Свидерским 13.11.2006 г. Поступило 13.11.2006 г.
Холинэстеразы (ХЭ), благодаря своей видовой и тканевой специфичности, образуют, пожалуй, самое многочисленное энзимологическое семейство [1]. Наиболее изученными ферментами считаются ацетилхолинэстераза (АХЭ) эритроцитов человека (НФ 3.1.1.7) и бутирилхолинэстераза (БХЭ) сыворотки крови лошади (НФ 3.1.1.8), которые служат "реперными" эталонами для сравнения с другими ХЭ. В Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН активно исследуется реакционная способность ХЭ животных, стоящих на разных уровнях эволюционного развития, среди которых видное место занимают гидробионты [1-3]. Достаточно подробно методом субстратно-ингибиторного анализа изучены свойства ХЭ зрительного ганглия тихоокеанского кальмара Todarodes раййсш (Ommatostrephes sloane-pacifucus). По субстратной специфичности фермент кальмара существенно отличался от "реперных" АХЭ и БХЭ и от ХЭ других животных. Важным тестом при изучении реакционной способности ХЭ является чувствительность к необратимым фосфорорганическим ингибиторам (ФОИ). Наши исследования, начатые в середине 60-х годов XX в. [4, 5], выявили у ХЭ зрительного ганглия тихоокеанского кальмара большое сродство к различным ФОИ (по сравнению с АХЭ и БХЭ эта ХЭ действовала "в силу сильного" [6]) и аномально высокую (в 1.5-3 тыс. раз более высокую, чем по отношению к АХЭ и БХЭ) чувствительность к О-этил^-неогексилме-тилтиофосфонату (соединение 3.27) [4-6].
В настоящей работе с целью оценки специфичности антихолинэстеразного действия необратимых ФОИ проведен сравнительный анализ чувствительности ХЭ тихоокеанского кальмара, некоторых гидробионтов, обитателей северо-западной
акватории Тихого океана, и млекопитающих к большой группе различных по структуре (в том числе гидрофобных) ФОИ.
Источником фермента служил гомогенат (10 мг лиофилизированной ткани в 1 мл воды) зрительных ганглиев половозрелых особей тихоокеанского кальмара T. pacificus обоего пола, выловленных в северо-западной акватории Тихого океана. Активность ХЭ определяли потенциометрическим [3, 5] и колориметрическим [7] методами с использованием в качестве субстратов ацетилхолинхлорида и аце-тилтиохолиниодида. Антихолинэстеразную эффективность оценивали по величине бимолекулярной константы (kn) скорости взаимодействия фОи с ХЭ [1-3]. При идентификации активности ХЭ в ткани зрительного ганглия кальмара использованы в качестве субстратов, кроме ацетилхолинхлорида, иодиды бутирилхолина и ацетил-ß-метилхолина ("Merk"). Все изученные ФОИ синтезированы в Институте элементоорганиче-ских соединений [1-3, 6]. Как было показано ранее [5], ХЭ тихоокеанского кальмара катализирует гидролиз самых различных холиновых эфиров, включая такие специфические субстраты АХЭ и БХЭ, как ацетил^-метилхолин и бутирилхолин. Это может быть следствием либо особых свойств ХЭ кальмара, либо наличия в ткани зрительного ганглия нескольких ХЭ, как это было показано для других видов кальмаров [1, 3]. Проверку гомогенности обычно проводят методом субстратно-ингибиторного анализа с набором специфических субстратов и ФОИ, а вывод тогда корректен, когда для каждого из ФОИ величины kn, измеренные с помощью разных субстратов, совпадают [8]. В табл. 1 приведены данные с использованием специфических эффекторов БХЭ (бутирилхолина и соединения 1.1) и АХЭ (ацетил^-метилхоли-на и соединения 1.2). Как видно из табл. 1, величина kjj для каждого из изученных ФОИ практически не зависела от природы субстрата, т.е. в ткани зрительного ганглия тихоокеанского кальмара содержится только одна ХЭ. Известно [3], что ти-
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург
Таблица 1. Проверка методом субстратно-ингибиторного анализа гомогенности активности ХЭ зрительных ганглиев особей тихоокеанского кальмара Т. расШсш различных сезонных популяций (антихолинэстеразная эффективность, ^
Летняя Осенняя Зимняя
№ популяция популяция популяция
соединения
Ингибиторы
субстрат
АХ БХ МХ АХ БХ АХ БХ
1.1 [(СН^СНОЩО^ 6.87 6.86 6.89 6.85 6.88 6.84 6.90
1.2 С2Н50(СН3)Р(0^С2Н^+(СН3)С2Н5 ■ СН3 804 7.64 7.56 7.50 7.64 7.56 7.61 7.58
1.3 С2Н50(СН3)Р(0^С2Н4СН(СН3)2 5.65 5.79 5.63 5.66 5.82 5.64 5.90
1.4 С4Н90(СН3)Р(0^С2Н^С2Н5 7.71 7.89 7.73 7.76 7.90 7.73 7.87
1.5 [(СН3)3ССЩСН3)0](СН3)Р(0^С2Н^С2Н5 4.53 4.56 - 4.53 4.53 4.53 4.58
Примечание. АХ - ацетилхолиниодид; БХ - бутирилхолиниодид; МХ - ацетил-Р-метилхолиниодид.
Таблица 2. Антихолинэстеразная эффективность (^ kII) некоторых ФОИ
№ соедине- Ингибитор Фермент
ния ХЭ кальмара АХЭ [1] БХЭ [1]
1.1 [(СН^СНОЩО^ 6.87 4.68 6.86
2.6 (C2H5O)(CHз)P(O)SC2H4SC2H5 5.72 4.61 3.72
1.2 С2Н50(СН3)Р(0^С2Н^+(СН3)С2Н5 ■ СН3 804 7.58 8.11 6.31
2.7 (C2H5O)2P(O)SC2H4SC2H5 5.24 4.28 4.23
2.8 (C2H5O)2P(O)SC2H4S+(CHз)C2H5 ■ СН3 804 7.76 6.48 6.32
2.9 (С2Н50)2Р(0^С2Н4^СН3)С6Н5 5.67 4.01 5.54
2.10 (С2Н50Ш0^С2Н4№(СН3)2С6Н5 ■ I- 8.73 6.95 8.83
2.11 (С2Н50Ш0^С2Н4С(СН3)3 5.32 1.76 3.38
2.12 ^О^О^С^ 3.92 1.51 4.02
1.4 С4Н90(СН3)Р(0^С2Н^С2Н5 7.79 5.62 5.20
1.5 [(СН3)3ССН(СН3)0](СН3)Р(0^С2Н^С2Н5 4.54 2.71 3.98
хоокеанский кальмар в северо-западной акватории Тихого океана образует сезонные популяции. Данные табл. 1 показывают, что, во-первых, у разных особей в ткани зрительного ганглия сохраняется гомогенность активности ХЭ и, во-вторых, что чувствительность ХЭ к изученным ФОИ у особей из разных популяций была одинаковой. Такая идентичность свойств ХЭ позволяет предполагать, что сезонные популяции Т. расШсш не обособлены генетически, что наблюдалось для некоторых других видов океанических кальмаров [1, 3, 9].
В табл. 2-4 суммированы данные по чувствительности ХЭ тихоокеанского кальмара к ФОИ самой различной структуры, в том числе к двум специально синтезированным гомологическим рядам гидрофобных ФОИ (табл. 3, табл. 4), что позволило оценить в полном объеме ингибитор-ную специфичность ХЭ тихоокеанского кальмара по отношению к ФОИ. Во-первых, по общей
чувствительности ХЭ кальмара не может быть отнесена ни к типу АХЭ, ни к типу БХЭ: в подавляющем большинстве случаев эффективность ФОИ была либо выше, чем у "реперных" ХЭ, либо, так сказать, "в силу сильного". Во-вторых, подобно ХЭ млекопитающих эффективность оние-вых ФОИ была на 2-3 порядка выше, чем у их не-метилированных бескатионных аналогов (табл. 2, соединения 1.2 и 2.6, 2.8 и 2.7, 2.10 и 2.9). В-третьих, для ХЭ кальмара более характерно повышение чувствительности к гидрофобным ФОИ (табл. 3, табл. 4). В-четвертых, среди гидрофобных ФОИ выявлены чрезвычайно активные ингибиторы ХЭ кальмара (например, соединения 3.27, 4.50, 4.51), сопоставимые по своей эффективности с ониевыми ФОИ (соединения 1.2 и 2.8).
Уникальной особенностью ХЭ тихоокеанского кальмара была чрезвычайно высокая чувствительность к ФОИ, содержащему в отщепляемой части молекулы неогексильную (3,3-диметилбу-
118
РОЗЕНГАРТ, БАСОВА
Таблица 3. Антихолинэстеразная эффективность гомологического ряда ФОИ общей формулы C2H5O(CH3)P(O)S-R
Таблица 4. Антихолинэстеразная эффективность (^ гомологических рядов ФОИ общей формулы R1-O(CH3)P(O)S-R2
№ соед. Фермент № соед. Фермент
R ХЭ кальмара АХЭ [1] БХЭ [1] Rl R2 ХЭ кальмара АХЭ [1] БХЭ [1]
3.13 СН3 3.92 2.61 2.41 4.38 СН3 С4Н9 3.18 2.42 1.76
3.14 С2Н5 3.51 2.34 1.81 4.39 С2Н5 С4Н9 5.04 3.08 2.92
3.15 С3Н7 3.74 2.72 2.14 4.40 С3Н7 С4Н9 4.70 3.75 3.65
3.16 С4Н9 5.04 3.06 2.92 4.41 С4Н9 С4Н9 5.49 4.15 4.08
3.17 С5Н11 5.04 3.42 3.41 4.42 С5Н11 С4Н9 5.42 3.83 4.20
3.18 С6Н13 5.36 4.19 4.58 4.43 С6Н13 С4Н9 5.42 3.62 4.70
3.19 С7Н15 4.89 4.32 4.52 4.44 С7Н15 С4Н9 6.11 3.65 6.04
3.20 С8Н17 5.11 4.56 4.62 4.45 С8Н17 С4Н9 5.18 3.61 5.56
3.21 С9Н19 5.28 4.49 4.53 4.46 С9Н19 С4Н9 5.12 3.79 5.85
3.22 С10Н21 5.20 4.19 4.58 4.47 С10Н21 С4Н9 4.81 3.46 4.79
3.23 СН2СН(СН3)2 4.48 3.20 2.83 4.48 (СН3)2СН С4Н9 3.46 3.50 2.65
1.3 (СН2)2СН(СН3)2 5.65 3.12 3.36 4.49 (СН3)2СНСН2 С4Н9 4.82 4.15 3.64
3.24 (СН^СЩСН^ 5.57 2.92 3.40 4.50 (СН3)2СН(СН2)2 С4Н9 6.51 4.79 4.53
3.25 (СН2)4СН(СН3)2 5.12 3.95 4.77 4.51 (СН3)2СН(СН2)3 С4Н9 7.18 5.63 4.59
3.26 (СН2)бСН(СН3)2 5.12 4.34 4.97 4.52 (СН3)2СН(СН2)4 С4Н9 5.43 3.97 4.81
3.27 (СН2)2С(СН3)3 6.42 3.20 3.67 4.53 (СН3)2СН(СН2)5 С4Н9 5.23 3.94 4.48
3.28 (СН2)3С(СН3)3 5.02 3.35 4.26 4.54 СН3 С6Н13 3.86 2.79 2.32
3.29 (СН2)4С(СН3)3 5.11 3.86 4.95 4.55 С2Н5 С6Н13 5.37 4.20 4.58
3.30 (СН2)5С(СН3)3 4.51 4.03 4.94 4.56 С3Н7 С6Н13 5.08 4.49 5.23
3.31 (СН2)бС(СН3)3 4.52 4.28 5.00 4.57 С4Н9 С6Н13 6.26 4.76 5.15
3.32 (СН2)2С(СН3)2С3Н7 6.45 3.20 4.40 4.58 С5Н11 С6Н13 6.23 3.58 4.80
3.33 (СН2)2С(СН3)2С2Н5 5.23 4.30 4.83 4.59 С6Н13 С6Н13 6.21 3.88 4.78
3.34 СН2С6Н5 5.80 - 4.18 4.60 С7Н15 С6Н13 4.83 3.75 2.43
3.35 (СН2)2С6Н5 4.69 4.08 4.15
3.36 3.37 (СН2)3С6Н5 (СН2)4С6Н5 5.28 5.23 4.26 4.57 4.93 5.04 гибитором ХЭ кальмара было соединение 3.32, ими-
тирующее неогексильную структуру. В -пятых
тильную) группировку (соединение 3.27). Во-первых, эффективность этого ФОИ по отношению к БХЭ и АХЭ была в 500-1500 раз ниже. Во-вторых, чувствительность ХЭ кальмара к деметилирован-ному (3-метилбутильному) аналогу (соединение 1.3) понизилась почти на порядок. В-третьих, нарушение неогексильной структуры, связанное с "отодвиганием" трет.-бутильной группировки от эфирной Б (соединения 3.27-3.31), понизило эффективность по отношению к ХЭ кальмара в 3080 раз. В-четвертых, в случае ХЭ кальмара мы наблюдали "узнавание" неогексильной структуры: из трех изомерных ФОИ с одинаковой длиной нормальной алкильной цепи и наличием диме-тильной группы у третьего (соединение 3.32), четвертого (соединение 3.33) и пятого (соединение 3.29) углеродных атомов самым сильным (в 17-20 раз) ин-
неогексильное производное диэтоксифосфорной кислоты (соединение 2.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.