БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1078-1086
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 612.73.014: 577.532
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КОНТРАКТУРНЫХ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ ОТВЕТОВ, ВЫЗЫВАЕМЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОМ И ХОЛИНОМ, В ФАЗНЫХ И ТОНИЧЕСКИХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКНАХ ЛЯГУШКИ
© 2008 г. И.Е. Катина, Г.А. Наеледов
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223, Санкт-Петербург,
пр. Тореза, 44
E-mail: katina@iephb.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
На изолированных пучках фазных и тонических мышечных волокон лягушки проведен сравнительный анализ сократительных ответов, вызванных ацетилхолином и заменой ионов N|+ в наружном растворе на ионы холина. Исследовано влияние внеклеточной концентрации Ca и ряда фармакологических агентов, модулирующих активность различных систем формирования уровня Ca в миоплазме: дантролена, крезола, d-тубокурарина, тетродотоксина. Установлено, что в волокнах обоих типов основным механизмом активации ацетилхолиновой контрактуры является потенциал-зависимый выброс Са из депо сар ко плазматического ре-тикулума. Однако фазные и тонические волокна отличаются по свойствам а-изоформы и(или) соотношению а- и Р-изоформ +рианодин-чувствительных каналов. В волокнах обоих типов замещение более 25% ионов Na на холин вызывает длительные контрактурные ответы, также опосредованные активацией ацетилхолиновых рецепторов. Предполагается, что в формировании сократительных ответов этого типа участвует дополнительный механизм, связанный с накоплением ионов холина в миоплазме и прямым воздействием на рианодин-чувствительные каналы.
Ключевые слова: фазные и тонические скелетные мышечные волокна, ацетилхолиновая контрактура, холин-индуцированная контрактура, рианодиновые рецепторы/каналы, дантролен, никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, d-тубокурарин.
В скелетных мышцах амфибий выделяют два основных типа мышечных волокон: фазные и тонические. Тонические волокна являются наиболее специализированными из скелетных мышечных волокон. В отличие от фазных волокон, они не генерируют потенциал действия и одиночное сокращение в ответ на короткий электрический стимул, но способны поддерживать устойчивый сократительный ответ при действии серии ритмических электрических стимулов или длительной деполяризации [1,2-5]. К настоящему времени накоплены многочисленные доказательства различия двух типов волокон по свойствам сократительного аппарата [3], типу иннервации и механизмам электроге-
Сокращения: CP - саркоплазматический ретикулум, РиР - рианодин-чувствительные рецепторы/каналы, DIRC -деполяризацией индуцированный выброс Ca2+ из CP, CIRC - Ca-зависимый выброс Ca2+ из CP, OC - одиночное сокращение, AX - ацетилхолинхлорид, AXK - ацетилхолиновая контрактура, ХлК - холин-индуцированная контрактура, nAChR - никотиновый ацетилхолиновый рецептор.
неза [1,2,4,5]. Однако до сих пор не сложилось общего представления о значении каждого из указанных факторов в формировании типовых особенностей сократительных реакций. В частности нет единого мнения о соотношении вклада деполяризацией индуцированного (DIRC) и Ca-зависимого выброса Ca2+ (CIRC) из депо саркоплазматического ретикулума (CP), о степени участия и механизме действия наружного Ca2+, а также о степени участия систем устранения избыточного Ca2+ в формировании длительных сокращений в тонических волокнах [1,2,5,6].
Известно, что в саркоплазматическом рети-кулуме скелетных мышц амфибий примерно в равной доле присутствуют две изоформы риано-дин-чувствительных рецепторов/каналов (PnP) -а и Р, которые гомологичны изоформам PиP1 и PиP3 млекопитающих [7,8]. Именно a-PnP непосредственно участвуют в электромеханическом сопряжении и определяют DIRC-компо-нент выброса Ca2+, тогда как Р-PиP, не имею-
щие прямого контакта с дигидропиридиновыми рецепторами, ответственны за ОЯС-механизм. Считается, что скорость этого процесса недостаточна для обеспечения реакции на деполяризацию [8,9], в тоже время он может вносить значительный вклад в формирование длительных сократительных реакций [6,10,16].
Оценка роли РиР системы в формировании сократительных ответов возможна благодаря существованию специфических фармакологических агентов. Результаты ряда работ [10-13] свидетельствуют о том, что дантролен ингиби-рует преимущественно БЖС-компонент выброса Са2+. Установлено также, что 4-хлоро-ж-кре-зол (крезол) является эффективным и специфическим активатором выброса Са2+ из СР через РиР1-каналы [14,15]. Показано, что оба препарата имеют высокую специфичность по отношению РиР1-изоформе по сравнению с РиР3 [12,13,15]. Отсутствие влияния на процессы элек-трогенеза и способность проникать сквозь клеточную мембрану делают эти препараты удобными инструментами в экспериментах на ин-тактных мышечных волокнах.
В нашей предыдущей работе [16] было исследовано влияние концентрации ионов Са2+ в наружной среде, дантролена и крезола на характеристики калиевой контрактуры у фазных и тонических скелетных мышечных волокон лягушки. Было показано, что в фазных волокнах входящий поток Са2+ может непосредственно создавать концентрацию, достаточную для поддержания длительного сокращения, тогда как в тонических волокнах его участие опосредовано Са2+-зависимой активацией Р-изоформы рианодин-чувствительных рецепторов. В задачи настоящей работы входил сравнительный анализ контрактурных ответов, вызываемых добавлением ацетилхолина (АХ) -ацетилхолиновая контрактура (АХК), в фазных и тонических волокнах. АХК - процесс, в котором задействована вся система электромеханического сопряжения, наиболее адекватно отражает формирование сократительного ответа в интактной мышце. В сочетании с воздействиями фармакологических агентов, специфических по отношению к потенциал- и лиганд-управляемым ионным каналам наружной мембраны и РиР-мембране саркоплазматического ретикулума, такой подход позволяет выявить звенья цепи электромеханического сопряжения, определяющие функциональную особенность каждого типа волокон.
Длительность сократительных реакций определяется также функционированием механизмов устранения избыточного Са2+ из миоплаз-мы, одним из которых является Ка+-Са2+ -
транспортер, локализованный в наружной мембране [17-19]. Движущей силой этого транспорта является электрохимический градиент ионов Na+, а при внеклеточной концентрации Na+ ниже 5 - 10 мМ возможен его переход в инвертированный режим, т.е. обратный перенос Ca2+ в миоплазму [17,20]. Одним из основных методических приемов исследования его активности является уменьшение внеклеточной концентрации ионов Na за счет замены на другие одновалентные катионы.
Для фазных скелетных мышечных волокон лягушки можно считать установленным, что ^+-Са2+-транспортер не оказывает существенного влияния на характеристики экспериментально вызываемых длительных сокращений [10,20]. В отношении тонических волокон имеются данные о том, что замена ионов Na на некоторые органические катионы, в том числе тетраэтиламмоний и холин, вызывает контрак-турные ответы, сила которых возрастает с увеличением доли замещения [6,21]. Полагают, однако, что действие холина может иметь более сложную природу [6,21,22]. В то же время именно этот катион часто используется в различных физиологических экспериментах в качестве «инертного» заместителя ионов Na, в том числе при оценке роли Na+-Ca2+-тpанcпоpтеpа [17]. В связи с этим мы провели исследования сократительных реакций при замещении ионов натрия на холин с целью выяснения механизмов активации и конечной мишени действия холина в скелетных мышечных волокнах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на пучках из 10 - 15 мышечных волокон, изолированных из мышц задней конечности лягушки Rana temporaria:: глубокого короткого разгибателя четвертого пальца (m. EBD IV), состоящего только из фазных волокон, и центральной части мышцы m. ileafibularis, содержащей преимущественно тонические волокна. Выделение тонического пучка проводили по морфологическим признакам [2,23], а окончательную проверку осуществляли в процессе эксперимента по наличию одиночного сокращения (ОС), характеру тета-нической суммации и скорости расслабления калиевой контрактуры [23].
Регистрировали сократительные реакции при разных способах активации: прямой электрической стимуляцией, высококалиевым раствором (60 - 120 мМ KCl) - калиевая контрактура, 4-хлоро-ж-крезолом, замещением ионов Na на другие одновалентные катионы, что позволяет задействовать различные звенья цепи
Рис. 1. Одиночные сокращения и контрактурные сократительные ответы пучка фазных волокон из мышцы т. ЕББ IV при воздействии ацетилхолина (5-10"4 М): (а) - в контрольном растворе (1), на фоне действия 0,15 мМ дантролена (2) и после воздействия 1 мкМ тетродоксина (3), интервал регистрации одиночного сокращения (ОС) (левая панель) - 0,2 с; (б) - в контрольном растворе (1) и после воздействия 0,1 мМ ¿/-тубокурарина (2). Через каждые 20 с подавался короткий электрический стимул для оценки амплитуды одиночного сокращения. Смена растворов указана на рисунке.
электромеханического сопряжения. Стандартный раствор Рингера имел состав (мМ): NaCl -120, KCl - 2,5, CaCl2 - 2, HEPES - 10, рН 7,3. При исследовании эффектов холина использовали растворы с эквимолярным замещением NaCl на холинхлорид (15 - 115 мМ). Для устранения ионов Cа2+ применяли номинально бескальциевый раствор, без добавления хелаторов или замещения ионов кальция на другие двухвалентные катионы. Использовали тетродоток-син, холинхлорид, HEPES, d-тубокурарин, дан-тролен натриевый и 4-хлоро-ж-крезол производства фирмы Sigma. Два последних препарата растворяли в промежуточном растворителе -диметилсульфоксиде (3 - 300 мМ) в день эксперимента и затем добавляли в раствор Рингера для создания конечной концентрации. При ана-
лизе влияния тетродотоксина, d-тубокурарина, дантролена и устранения ионов Са2+ применяли предварительную экспозицию в течение 15 - 30 минут для установления равновесия концентрации исследуемого агента между наружным раствором, T-системой, синаптической областью или миоплазмой по всему объему пучка.
Регистрацию мышечного сокращения осуществляли с помощью механоэлектричес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.